مرکز منطقه ای اطلاع رساني علوم و فناوري - طراحي كنترل داخلي واكنش زنجيره‌اي پليمراز باكتري مايكوپلاسما به روش رقابتي

چكيده لاتين :

چكيده سابقه و هدف: مايكوپلاسماها مهمترين و جدي‌ترين آلوده‌كننده‌هاي فرآورده‌هاي بيولوژيك توليدي در كشت‌هاي سلولي مي‌باشند. تكنيك PCR جهت شناسايي سريع جنس مايكوپلاسما، از اولويت بالايي برخوردار است. اما يكي از معايب اين روش، نداشتن كنترل داخلي است. هدف اصلي اين مطالعه، استاندارد كردن تست PCR تشخيص جنس مايكوپلاسما از طريق ساخت كنترل داخلي به روش رقابتي است. مواد و روش‌ها: با استفاده از پرايمرهاي ويژهي هدف 16S rRNA، تست PCR جهت تشخيص مولكولي جنس مايكوپلاسما بهينه شد. پرايمرهاي مركب (Composite Primer) براي كنترل داخلي با استفاده از پرايمرهاي ژن كينتوپلاست انگل ليشمانيا طراحي و سپس قطعه‌ي كنترل داخلي تكثير گرديد. هر دو محصول هدف و كنترل داخلي بعد از خالص‌سازي به پلاسميد PTZ57 R اتصال و سپس در باكتري اشرشيا كلي JM107 ترانسفورم و نهايتاً كلون گرديد. يافته‌ها: اندازهي محصول تشخيصي و كنترل داخلي به ترتيب 272bp و 672bp بود، كه از نظر اندازه، اختلاف مطلوبي با هم داشتند. تعداد حداقل كنترل داخلي در هر واكنش، 1000 عدد تعيين شد. حساسيت تست PCR براي تشخيص جنس مايكوپلاسما، 10 باكتري به دست آمد. در تست ويژگي با عوامل مختلف، هيچ محصول ناخواسته‌اي مشاهده نشد. طيفي كه در آن تكثير كنترل داخلي مشاهده شد، بين صد تا ده ميليون باكتري بدست آمد. نتيجه‌گيري: در كنار سرعت و دقت بالاي تكنيك PCR، نتايج منفي و مثبت كاذب كه به دليل وجود مهاركننده‌هاي واكنش PCR رخ مي‌دهند، مي‌تواند كارايي اين روش را كاهش دهد. استفاده از يك DNA ديگر به عنوان كنترل داخلي مي‌تواند اين خطاها را شناسايي كند. Abstract: Background and Aim: Mycoplasma is one of the smallest alive microorganisms, having the ability of transmitting from microbiological filters makes it to be a severe and important contaminant for cell culture, biological and biotechnological products. Using a rapid and sensitive method for diagnosing Mycoplasma’s infection is the first priority. This method should be able to discover typical Mycoplasma’s infection, but for meeting the standard we need to produce the internal control competitively in Mycoplasma spp PCR recognizing, which is the main aim of the project. Materials and Methods: Using of special primers for IS6110 target, PCR test was optimized. Besides, the composite primers for IC- M. spp were designed then the PCR was optimized. The IC- M. spp which amplified in constringent condition, was ligated in pTZ57R plasmid, transformed in E.coli JM107 and was cloned. Specification, sensitivity of test and the number needed in each test. Also PCR with internal control were defermined. The number of IC, which is needed in each PCR reaction was scanned in the matter of dilution and PCR response with IC. Results: PCR amplicon for Mycoplasma spp and IC- M. spp with special primers were 272bp and 660bp respectively, so there was a significant different between their size. Conclusion: Despite the high speed and accuracy of PCR, false positive and negative results, which are caused because of PCR inhibitors, are the important problems of this technic that can reduce its efficiency. Using another DNA as an internal control can detect these inhibitors. Indeed, amplification of this DNA shows correct amplification and detection steps.