دورگه‌سازي در محل؛ اصول و كاربردها : مقاله مروري

In situ hybridization; principles and applications: review article

دورگه‌سازی در محل، روشی است كه در آن از پروب‌های اسيد نوكلئيك برای بررسی انواع تغييرات ژنتيكی در سلول‌های دست‌نخورده و بافت‌های تثبيت‌شده استفاده می‌شود. مراحل مختلف اين روش شامل انتخاب پروب، آماده‌سازی نمونه، تيمار پيش از دورگه‌سازی، دورگه‌سازی، شستشو، آشكارسازی و روند كنترل می‌باشند. انتخاب پروب مناسب يكی از جنبه‌های مهم انجام فرايند دورگه‌سازی موفقيت‌‌آميز است. حساسيت و ويژگی In situ Hybridization (ISH) می‌تواند توسط عوامل مختلفی مانند ساختار پروب، روش نشاندار كردن، درصد جفت بازهای GC، طول پروب و سيستم آشكارسازی سيگنال تحت تاثير قرار گيرد. تهيه پروب‌ها به چندين روش انجام می‌گيرد و از مواد راديواكتيو و غيرراديواكتيو جهت نشاندار كردن آنها استفاده می‌شود. مرحله آماده‌سازی، با هدف حفظ اسيدهای نوكلئيك در نمونه، حفظ مورفولوژی سلول‌ها و بافت و افزايش نفوذ پروب به داخل نمونه انجام می‌گيرد. پس از مرحله آماده‌سازی، محلول حاوی پروب جهت انجام فرايند دورگه‌سازی به نمونه اضافه شده و پس از انكوباسيون يك شبه، پروب‌های متصل‌نشده از طريق شستشو، حذف می‌گردند. نحوه آشكارسازی سيگنال‌ها با توجه به نوع ماده مورد استفاده برای نشاندار كردن پروب‌ها متفاوت خواهد بود. استفاده از فرايندهای كنترل گوناگون برای اطمينان از ويژگی دورگه‌سازی، اهميت بسياری دارد. در تكنيك‌های مختلفی مانند Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)، Chromogenic in situ hybridization (CISH)، Genomic in situ hybridization (GISH)، Comparative genomic hybridization (CGH)، Spectral karyotyping (SKY) و Multiplex fluorescence in situ hybridization (MFISH)، از دورگه‌سازی در محل استفاده می‌شود. اين تكنيك‌ها كاربردهای بسيار مهمی در تشخيص سرطان، بيماری‌های ژنتيكی و عفونی دارند. در اين مقاله مروری فرايند دورگه‌سازی در محل، انواع مختلف آن، كاربردها، مزايا و معايب هر يك از آنها مورد بررسی قرار گرفته است.

In situ hybridization (ISH) is a method that uses labeled complementary single strand DNA or RNA to localize specific DNA or RNA sequences in an intact cell or in a fixed tissue section. The main steps of ISH consist of: probe selection, tissue or sample preparation, pre-hybridization treatment, hybridization and washing, detection and control procedure. Probe selection is one of the important aspects of successful hybridization. ISH sensitivity and specificity can be influenced by: probe construct, efficiency of labeling, percentage of GC, probe length and signal detection systems. Different methods such as nick translation, random priming, end tailing and T4 DNA polymerase replacement are used for probe generation. Both radioactive and non-radioactive labels can be used in order to probe labeling. Nucleic acid maintenance in samples, prevention of morphological changes of samples and probe penetration into tissue section are the main aims of sample preparation step. Then, a small amount of solution containing probe, is added on slides containing tissue sections for hybridization process, then slides are incubated overnight. Next day, washes are carried out to remove the probes which are not bound to target DNA or RNA. Finally, in order to be sure that the observed labeling is specific to the target sequence, using several control procedures is very important. Various techniques based on ISH consist of: Fluorescence in situ hybridization (FISH), chromogenic in situ hybridization (CISH), genomic in situ hybridization (GISH), comparative genomic hybridization (CGH), spectral karyotyping (SKY) and multiplex fluorescence in situ hybridization (MFISH). One of the most common techniques of ISH is fluorescence in situ hybridization. FISH can be used to: 1) detect small deletions and duplications that are not visible using microscope analysis, 2) detect how many chromosomes of a certain type are present in each cell and 3) confirm rearrangements that are suspected after microscope analysis. In this technique different fluorescent labels are attached to the probes. In this review article ISH, its different types, their application, advantages and disadvantages have been considered.