پديد آورندگان :
مصري، رقيه نويسنده 1Department of Cell and Molecular Biology, Kharazmi University, Tehran, Iran mesri, R , اسمعيلي زاد، مجيد نويسنده 2Department of Central labratoary, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Karaj, Alborz, Iran. Esmaelizad, M , انگجي، سيد عبدالحميد نويسنده 1Department of Cell and Molecular Biology, Kharazmi University, Tehran, Iran Angaji , SA , طهماسب، محمد نويسنده 1Department of Cell and Molecular Biology, Kharazmi University, Tehran, Iran Tahmaseb , M , احمدزاده، مژگان نويسنده 1Department of Cell and Molecular Biology, Kharazmi University, Tehran, Iran Ahmadzadeh , M , محمدي، سميه نويسنده 1Department of Cell and Molecular Biology, Kharazmi University, Tehran, Iran Mohammadi , S
كليدواژه :
كلونينگ , DNA vaccine , ECHINOCOCCUS GRANULOSUS , P14-3-3 , اكينوكوكوس گرانولوزوس , CLONING
چكيده فارسي :
زمينه و هدف: كيست هيداتيك در اثر آلودگی با لارو انگل اكينوكوكوس گرانولوزوس ايجاد میشود. در مرحله لاروی اين انگل آنتیژنهای متعددی توليد میشود كه يكی از اين آنتیژنها، آنتیژنی از خانواده پروتئينهای p14-3-3 میباشد و واكسن نوتركيب آن ايمنی‌زايی قابل توجهی را در موش القا كرده است. با توجه به ايمونوژنتر بودن نواحی اپیتوپی آنتیژنها و توليد پاسخ ايمنی Th1 مطلوب هدف از اين مطالعه كلون كردن اپیتوپهای خطی اين آنتیژن شناسايی شده در وكتور N1–pEGFP بود كه در ساخت يك مدل DNA واكسن مؤثر بود.
روش بررسی: در اين مطالعه تجربی پس از شناسايی اپیتوپهای خطی آنتیژن p14-3-3 توسط نرمافزارهای بيوانفورماتيكی، توالی كدكننده آن به صورت سنتتيك فراهم شد، پس از تكثير با واكنش PCR و هضم توسط آنزيم محدود كننده XhoI، در وكتور N1 – pEGFP تخليص شده با روش سمبروك تغيير يافته كه همراه با استفاده از CaCl2 وPEG6000 میباشد كلون شده و كلونیهای مثبت حاوی وكتور نوتركيب ابتدا به روش colony PCR و سپس توالی‌يابی تأييد شد. برای بررسی بيان در سلولهای يوكاريوت با روش الكتروپوريشن به رده سلولیCHO منتقل شدند.
يافتهها: توالی كد كننده اپیتوپهای خطی آنتیژن P14-3-3 انگل اكينوكوكوس گرانولوزوس پس از شناسايی، سنتز و تكثير در وكتورpEGFP-N1 كه تخليص آن با روش جديد به خوبی با حداكثر غلظت پلاسميد و حداقل مقدار RNA همراه است، كلون شده و پس از تأييد كلونينگ، بيان آن نيز در رده سلولی CHO به عنوان نمونهای از سلولهای يوكاريوت به صورت موفقيتآميز با ميكروسكوپ فلورسنت انجام شد و استفاده از سازه حاصل در قالب واكسن ژنی برای بررسی پاسخ ايمنی در مدلهای موشی در مراحل بعدی پژوهش انجام خواهد شد.
نتيجهگيری: نتايج حاصل از توالی يابی، تأييد كننده كلونينگ صحيح توالی كد كننده اپیتوپهای خطی آنتیژن ζ P14-3-3 انگل اكينوكوكوس گرانولوزوس در وكتور pEGFP-N1 بوده و نتايج حاصل از ميكروسكوپ فلورسانس نشانگر بيان موفقيتآميز پروتئين نوتركيب در سلول يوكاريوتیCHO میباشد.
واژه‌های كليدی: اكينوكوكوس گرانولوزوس، كلونينگ، DNA واكسن،P14-3-3
خش وارد كنيد
چكيده لاتين :
ABSTRACT
Background & purpose: Hydatidosis is a zoonotic disease that caused by infection with the larvae of Echinococcus granulosus. Different antigens produced in larval stage of this parasite that recombinant vaccine base these antigens created significant immunity in infected animals. One of the important antigens is p14-3-3 that it's recombinant antigen created considerable immunity in mouse models. In this study according to the high immunity of antigen epitopes region the coding sequence of T-cell epitopes of P14-3-3 was cloned into pEGFP-N1vector in order to produce an effective DNA vaccine model to stimulate high level of Th1 immune response.
Material and method: In this study bioinformatics tools were used to prediction of linear T-Cell epitopes of Echinococcus granulosus P14-3-3 ζ antigen. The nucleotide coding sequence of these epitopes was synthesized by PCR. the ampliqon was digested with XhoI restriction enzyme and cloned into pEGFP–N1 vector That has been purificated by modified sambrook method with CaCl2 and PEG6000..Positive colony was selected by direct colony PCR and confirmed by the sequencing.and evaluation of it's expression in Eukaryotic cells was done by transformed to CHO cell line with electroporation.
Results: Linear T-cell epitopes of Echinococcus granulosus P14-3-3 after prediction,synthesis and amplification wae successfully cloned into pEGFP-N1 vector that purificated by new method with maximum vector and minimum RNA concentration.The expression of new constract in CHO cell line as a eukaryotic cells achivment by fluorescent microscope and will be used as a DNA vaccine model to evaluation immuno response in mouse models.
Discussion: Successfully cloning of The linear T-cell epitppes coding sequence of Echinococcus granulosus P14-3-3ζ antigen into pEGFP-N1 verificated by sequencing and fluorscent microscope images demonstrated expression of recombinant protein in CHO cell line
