ساخت ناقل لنتي ويروسي بر پايه ويروسHIV-1 با كاربري انتقال ژن به سلول‌هاي تقسيم شونده و غير تقسيم شونده

Construction of lentiviral vector based on HIV-1 virus for gene transfer to dividing and non-dividing cells

چكيده مقدمه:روش‌هاي زيستي انتقال ژن يا استفاده از ناقل‌هاي ويروسي، كاربرد گسترده‌اي در اهداف درماني دارد. استفاده از ناقل هاي لنتي ويروسي با داشتن مزايايي چون توانايي آلوده‌سازي سلول‌هاي تقسيم شونده و غير تقسيم شونده، توان حمل قطعه ژني بزرگ و بيان پايدار ژن خارجي، ابزاري مناسب براي انتقال ژن در كاربردهاي تحقيقاتي و درماني به شمار مي‌آيند. هدف از اين پژوهش توليديك ناقل لنتي ويروسي بر مبناي (HIV-1Human Immunodeficiency virus) با پوششي از ويروس وزيكولار استوماتيس(vesicular stomatitis virus glycoprotein-G: VSVG) بود. اين ناقل مي‌تواند به عنوان وسيله‌اي براي انتقال ژن به سلول‌هاي تقسيم شونده و غير تقسيم شونده، در انواع مطالعات تحقيقاتي و درماني، مورد استفاده قرار بگيرد. مواد و روش‌ها:روش كلسيم فسفات براي ترنسفكشن همزمان سه پلاسميد شامل پلاسميد بيان كننده ژن خارجي به همراه گزارشگر بياني(pWPXL-GFP)، پلاسميد بيان كننده پروتيين‌هايgag و polpsPAX2 و پلاسميد بيان كننده گليكوپروتيين پوشش(pMD2.G)، بر روي رده سلولي كليه جنين انسان، انجام گرفت. تاييد ترانسفكشن با استفاده از فلوسيتومتري انجام گرفت و پس از تغليظ ويروس‌ها، ترانسداكشن بر رده سلولي هدف انجام شد. يافته‌ها:نتايج فلوسيتومتري بيان 37/ 51 درصد از ژن گزارشگر پروتيين سبز فلورسانت(Green Fluorescent Protein:GFP) را در سلول‌هاي ترانسفكت شده نشان داد. پس از تغليظ ويروس و انجام ترانسداكشن؛ دخول پروويروس به ژنوم سلول هدف و بيان طولاني مدت GFP در اين سلول‌هابامشاهدهبه وسيله ميكروسكوپ فلورسانت، 15روز پس از ترانسداكشن ارزيابي شد و نتايج مثبت گزارش شد. نتيجه‌گيري:بيان ژن گزارشگر در سلول‌ها،پس از ترانسداكشن، صحت ورود ناقل ويروسي را به سلول‌ها نشان داد و به اين ترتيب ناقل توليد شده در اين پژوهش علاوه بر كارايي انتقال ژن به دليل ماهيت لنتي ويروسي آن، توانايي انتقال ژن به سلول‌هاي غير تقسيم شونده را نيز علاوه بر سلول‌هاي تقسيم شونده دارا مي‌باشدكه موجب كاربرد گسترده تر آن، نسبت به ساير ناقل‌هاي ويروسي، در مطالعات انتقال ژن مي‌شود. كليد واژه‌ها:انتقال ژن، ناقل لنتي ويروسي، ترانسفكشن، كلسيم فسفات، ترانسداكشن

Abstract Introduction: Biological methods or viral vectors are used extensively for gene transfer for therapeutic aims. Lentivial vectors, with advantages such as the capacity of transducing dividing and non-dividing cells, carrying large genetic payloads and stable long-term transgene expression, are considered suitable tools for gene transfer for research and therapeutic purposes. The aim of this study was to produce a lentiviral vector based on HIV-1, with vesicular stomatitis virus glycoprotein-G: VSVG. This vector can be used as a tool for gene transfer to dividing and non-dividing cellsfor research and therapeutic purposes. Materials and methods: Calcium phosphate method was used for co-transfection of three plasmids pWPXL-GFP (expression vector with reporter gene), psPAX2 consisting of gag, pol gene of HIV-1 virus and pMD2.G (Envelope vector) on HEK293T human embryo cell line. Flow cytometry technique was used for assessment of green fluorescent protein (GFP) expression as a reporter gene. Viruses were concentrated and used for transduction on the target cell line. Results: GFP expression was observed in 51.37% of transfected HEK293T cell line. After concentrating the viruses and transduction, pro-virus penetration into the target cell genome was observed with long-term green positive expression in transduced cells using fluorescent microscopy 15 days after transduction. Conclusion: The ability of constructed viruses to enter host cells was confirmed by GFP expression in these cells. The lentivirus (and therefore the vector) produced in this study proved effective in transducing dividing and non-dividing cells, making it more efficient than other viral vectors in gene transfer investigations. Key words:Calcium phosphate, Gene transfer, Lentiviral vectors, Transduction, Transfection.