بهبود و توسعه ميزان بيان ، حلاليت و تسهيل تخليص آنزيم نوتركيب پروتياز (rPR) ويروس HIV با روش TOPO-Cloning در باكتريBL21

Development of HIV-1 recombinant protease (rPR) expression, solubility and purification problems by TOPO-Cloning in E.Coli BL21

سابقه و هدف : پروتياز HIV نقش مهمي در بلوغ ويروس و تحريك پاسخ ايمني ميزبان دارد. به همين دليل مي تواند هم به عنوان يك هدف درماني و هم در تست هاي تشخيصي كاربرد داشته باشد. در مطالعات قبلي، توليد rPR با مشكلاتي مثل سميت، آبگريز بودن و تخليص روبرو بوده است. هدف از اين مطالعه، استفاده از سيستم بياني pET102/D.TOPO براي غلبه بر مشكلات اشاره شده بود. مواد و روشها: پس از جداسازي ژن پروتياز از ژنوم HIV، فرايند كلونينگ با استفاده از سيستم TOPO Cloning در وكتور بياني pET102/D.TOPO انجام شد. بعد از القاي بيان ژن با IPTG، پروتيين توليد شده با استفاده از روش كروماتوگرافي حاوي ستون Ni-NTA تخليص شد و غلظت آن با استفاده از كيت بررسي پروتيين BCA سنجيده شد. توليد پروتيين نوتركيب با SDS-PAGE و وسترن بلاتينگ بررسي شد. يافته ها : كلونينگ ژن پروتيازHIV-1 با استفاده از سيستم كلونينگ TOPO در وكتور بياني pET102/D بوسيله PCR با موفقيت صورت گرفت و با sequencing تاييد شد. غلظت rPR پس از تخليص بين 60 تا 85 ميكروگرم در ميلي ليتر بود. بيان و توليد rPR به شكل محلول، با موفقيت انجام شد. و با SDS-PAGE و وسترن بلات تاييد شد. بحث و نتيجه گيري : در سيستم كلون سازي مورد استفاده به دليل بيان rPR به صورت فيوز شده با تيوردوكسين و داراي برچسپ هاي هيستيديني، مشكل سميت،آبگريز بودن و تخليص تا حد زيادي برطرف شد. با توجه به ميزان rPR توليد شده، مي توان از آن در تست هاي تشخيصي و جهت بررسي و طراحي مهاركننده هاي پروتياز در مطالعات بعدي استفاده كرد.

Background and Aim: HIV protease plays an important role in the maturation of the virus and host immune response stimulation; therefore it could be important as therapeutic target and can be used in diagnostic tests. In previous studies, producing rPR has been faced with problems such as toxicity, hydrophobic and purification. The purpose of this study is use of expression system pET102/D.TOPO to overcome the mentioned problems. Methods: Protease gene was isolated from the serum of an infected individual. Cloning process was performed by TOPO Cloning system. Protease gene transformed into E.coli BL21and induced with IPTG. Produced recombinant protein was purified by affinity chromatography (Ni-NTA column). Protein concentration was checked by BCA protein assay kit. Recombinant protein was identified by SDS-PAGE and western-blotting. Results: HIV-1 protease gene Cloning using TOPO Cloning vector expression system pET102 / D was confirmed by PCR and sequencing. rPR concentration after purification was 60 to 85 micrograms per milliliter. rPR Expression and Immunogenicity by SDS-PAGE and Western blotting confirmed. Conclusion: expression and production of rPR in soluble form was Success. In used Cloning system, because of expression of rPR in fused form with thioredoxin and histidine tags, problems of toxicity, hydrophobicity and purification was greatly solved. According to the generated rPR, it can be used to evaluate the diagnostic tests and for designing of protease inhibitors in subsequent studies.