تعيين هويت مولكولي آسپرژيلوس پارازيتيكوس و فلاووس در نمونه‌هاي علوفه با روش Duplex PCR و مقايسه با روش‌هاي كشت و مستقيم

آسپرژيلوزيس بيماري عفوني انسان و طيور است كه موجب مشكلات عديده در آنها مي‌شود. هدف اصلي اين مطالعه، ارزشيابي دو روش آزمايشگاهي (سنتي و مولكولي) در تشخيص آسپرژيلوس فلاوس و پارازيتيكوس و مقايسه اين دو روش مي باشد. بعد از استخراج DNAهاي سوش‌هاي استاندارد آسپرژيلوس پارازيتيكوس و فلاووس به همراه پرايمرهاي هر قارچ و تست PCR، ژن‌هاي هر قارچ تكثير و محصول PCRبه روش TA cloning با استفاده از پلاسميد PTZ57R كلون گرديد پس از بهينه‌سازي تست‌‌هاي PCR و PCR Duplex 50 نمونه به روش PCR Duplex، كشت و آزمايش مستقيم آزمايش شدند. در تست اپتيمايز شده PCR، محصول bp 343 و bp 413 آسپرژيلوس پارازيتيكوس و فلاووس به ترتيب تكثير گرديد. 50 نمونه علوفه به روش Duplex PCR ، كشت و آزمايش مستقيم آزمايش شدند. در آزمايش Duplex PCR ، كشت و آزمايش مستقيم بر روي نمونه‌ها، 13 نمونه با Duplex PCR و 15 نمونه با آزمايش مستقيم و كشت مثبت شد و 26 نمونه با هر دوروش منفي بودند. نتايج بدست آمده از آزمايشات فوق توسط آزمون MacNemar بين نتيجه مستقيم و كشت از يك سو و نتيجه Duplex PCR از سوي ديگر انجام شده توافق بين دو تست مي‌باشد P=0.824. طبق نتايج بدست آمده از نظر تشخيص، تفاوت معني داري بين دوروش آزمايشگاهي وجود نداشت هرچند روش Duplex PCR پاسخ‌دهي سريعتري نسبت به روش‌هاي سنتي داشت و قادر به تشخيص آسپرژيلوسپارازيتيكوس در نمونه‌ها شد.

Aspergillosis is one of infectious disease that it causes difficulties for human and poultry. The main aim of this study is the diagnosis of Aspergillus parasiticus and flavus in forage samples by Duplex PCR method and comparison with culture and direct examination. After extracting DNAs of standard strains of Aspergillus parasitcus and flavus along with primers of each fungus and PCR testing, genes of each fungus were amplified and PCR product was cloned using TA cloning by pTZ57R plasmid. After optimizing Duplex PCR (D-PCR) monoplex PCR tests, 50 forage samples by Duplex PCR method, culture and direct were tested.In the optimized PCR test, 343bp and 413bp products of Aspergillus parasiticus and flavus were respectively amplified. Fifty samples of forage by Duplex PCR method, culture and direct were tested. 13 samples were positive only by Duplex -PCR and 15 samples by both tests direct and culturing were positive and 26 samples were negative with three methods. Results of McNemarʹs test is equal about the three methods tests for diagnosing Aspergillus parasiticus and flavus (p=0.824). Molecular methods such as D-PCR are faster techniques than direct testing and culturing for diagnosis of Aspergillus parasiticus and flavus but there arenʹt difference between three methods for diagnosing Aspergillus parasiticus and flavus but with D-PCR we could diagnosis Aspergillus parasiticus.