ايجاد پلاك توسط سويه V4ويروس عامل بيماري نيوكاسل بر روي كشت سلولي و بررسي مولكولي با روش واكنش زنجيره پليمراز نسخه‌برداري معكوس RT-PCR))

امروزه در بسياري از كشورهاي دنيا واكسن كلون شده مورد استفاده قرار مي‌گيرد. جهت كلون كردن يك ويروس، يكي از راه‌ها رشد ويروس بر روي كشت سلول و جدا كردن پلاك‌هاي مجزا و متفاوت و بررسي آنها از لحاظ مورفولوژي و ژنتيكي است. دراين تحقيق، ابتدا سلول‌هاي ) Madin-Darby Canine Kidney MDCK) بصورت تك لايه و بطور استاندارد كشت داده شد. رقت هاي مختلف ويروس به سلول‌هاي تك لايه MDCK همراه با تريپسين، آگار و سولفات منبزيوم اضافه شد. ويروس توانست بر روي سلول‌هاي فوق تكثير و ايجاد اثر سايتوپاتيك (CPE) و پلاك نمايد. در رقت 6-10 تعداد 6 پلاك كه از لحاظ شكل و اندازه تفاوت داشتند برداشته شدند و جهت تكثير به تخم‌مرغ جنين دار 11-9 روزه تلقيح گرديد. بعد از 48 ساعت مايع آلانتوييك هر تخم‌مرغ حاوي پلاك برداشت ونسبت به جداسازي RNA هر پلاك اقدام گرديد. منطقه شكست (Cleavage site)پروتيين ادغامي(Fusion) با تست RT-PCR انجام شد و محصول PCR خالص‌سازي وسكانس گرديد. سكانس نوكليوتيدها و آمينواسيدها براي هر پلاك با سوش هاي ثبت شده در بانك ژني مقايسه شد. سكانس نوكليوتيدهاي تمامي پلاك‌هاي بدست آمده، 97 تا 99% همخواني با ويروس V4در بانك ژني را تاييد نمود. هدف از اين پژوهش ايجاد پلاك از سوش V4 ويروس نيوكاسل بر روي سلول‌هاي MDCK جهت ايجاد پلاك‌هاي مجزا و در نهايت بررسي مولكولي پلاك‌هاي ايجاد شده مي‌باشد.

Cloned vaccines are used in many countries nowadays. One of the ways for cloning a virus is propagation of the virus on cell culture to obtain discrete different plaques in order to study their morphology and genetics. In this study monolayer Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell cultures were prepared by standard method. Various dilutions of the viruses were inoculated into monolayer MDCK cell cultures that were supplemented with magnesium sulfate and trypsin, and over laid with agar medium. The viruses could reproduce on these cells and caused cytopathic effect and plaques. At 10-6 virus dilution, 6 various shape and size discrete plaques were obtained and inoculated into allantoic fluid 9-11 days embryonated eggs. After 48 hrs, the allantoic fluids contain plaques were harvested and their RNA extracted. Cleavage site of fusion protein, with RT-PCR test was performed and the PCR products were purified and sequenced. The sequences of nucleotides and amino acids for each plaque were compared with those of the registered strain at gene bank as well as with each other. Molecular studies showed that all plaques are lentogenic strain of Newcastle disease virus and has about 97% to 99% homology with the strain V4 in the gene bank. The aim of this study is produce clear plaque by V4 strain of NDV on MDCK cell line and studies the molecular variations among them.