جدا‌سازي و همسانه‌سازي ژن منگنزپراكسيداز (mnp) از قارچ صدفي خوراكي

Isolation and cloning of manganese peroxidase (mnp) gene from oyster mushroom

در قارچ‌ صدفي خوراكي (Pleurotus ostreatus) آنزيم‌هاي مختلفي از ابتداي رشد ميسليومي تا انتهاي دوره‌ي ميوه‌دهي، تجزيه تركيبات ليگنيني را در محيط كشت بر عهده دارند. چوب، بقاياي گياهي و بيشتر ضايعات گياهي ديگر در طبيعت تحت عنوان تركيبات ليگنوسلولزي ناميده مي‌شوند. ليگنوسلولز عمدتاً از سلولز، همي‌سلولز و ليگنين تشكيل مي‌شود. آنزيم منگنزپراكسيداز (EC:1:11:1:13)، يكي از عمومي‌ترين پراكسيدازهاي تخريب‌كننده ليگنين است كه توسط اكثر قارچ‌هاي تجزيه‌كننده چوب و نيز بسياري از قارچ‌هاي تجزيه‌كننده كمپوست توليد مي‌شود. در اين پژوهش به‌منظور جداسازي cDNA ي ژن mnp قارچ صدفي خوراكي (P. ostreatus var. florida)، استخراج RNAو سپس سنتز cDNA انجام و بر اساس توالي ژن mnp و با استفاده از نرم‌افزار Primer Premier (V. 5.0) آغازگرها طراحي گرديد و با واكنش زنجيره اي پليمراز تكثير شد. قطعه تكثير شده در ناقل PTG19-T وارد شد و با استفاده از توالي‌يابي تاييد شد. در ادامه، ژن mnp در ناقل p13H88 همسانه‌سازي گرديد. سپس با روش يخ-ذوب به Ecoli (سويه‌يDH5? ) منتقل و تاييد حضور آن در باكتري با روش هضم آنزيمي انجام گرفت. نتايج نشان داد كه ژن mnp در ناقل p13H88 همسانه‌سازي شده است. پلاسميد نوتركيب بدست آمده با نام p13H88-FM نامگذاري شد.

Different enzymes in oyster mushroom (pleurotus oatreatus), can degradate the lignin compounds from the beginning of mycelium growth up to the end of fruiting period in the environment of compost and straw. Wood, plant residue and most of plant wastes in the nature are called lignocelluloses compounds. Lignocelluloses is mainly composed of cellulose, hemicelluloses and lignin. Magnesium peroxides enzyme (EC:1:11:1:13) is one the most common peroxides destroying lignin which produced by most wood decomposing mushrooms as well as many compost decomposing mushrooms. In order to cloning of mnp gene, RNA was extracted from oyster edible mushroom (P.ostreatus var.florida) and cDNA was synthesized and then the primers was designed based on the sequence of the mnp gene using Primer Premier (V.5.0) software and was amplified by PCR. First, the gene was inserted to pTG-19T plasmid and was confirmed using sequencing. In continue, mnp gene was cloned in to the p13H88 plasmid. Then it was transferred to Ecoli (DH5a) using ice-melt method and its presence was confirmed by enzymatic digestion. The results showed that mnp gene is cloned in p13H88 plasmid and the recombinant plasmid was named as p13H88-FM.