جايگزيني سيستيين 11 با سرين ‎در يكي از ايزوفرم‌هاي تيوردوكسين برنج (OsTrx23)‏ ‎‏ با روش جهش‌زايي هدايت شده‎ و اثر ‏آن بر ميزان دايمر شدن و فعاليت احيايي

Effect of substitution of Cys11 by Ser on the activity and dimerization of one of rice thioredoxin isoforms (OsTrx23) using site-directed mutagenesis

تيوردوكسين (Trx) ها، پروتيينهايي كوچك هستند كه با داشتن يك گروه تيول- ديسولفيد در جايگاه فعالشان نقش مهمي در تنظيم اكسايش- احياي سلولي دارند. برخلاف جانوران و پروكاريوت‌ها، در گياهان ايزوفرم هاي مختلفي Trx وجود دارد كه بر اساس مجل آنها در سلول در هشت زيرگروه f، m، x، y، z، o، s و h قرار مي‌گيرند. ايزوفرمهاي مختلفي از Trx h‏ در سيتوپلاسم سلول هاي گياهي وجود دارند. از جمله در برنج نه ايزوفرم Trx h وجود دارد كه از اين ميان ايزوفرمهاي OsTrx20، OsTrx1، OsTrx23 و OsTrx18 علاوه بر دو اسيد‌آمينه‌يCys در جايگاه فعال، داراي يك يا دو Cys اضافي در انتهاي آمين توالي خود نيز ميباشند. در پژوهش حاضر به منظور بررسي نقش Cys انتهاي در توالي پروتيين OsTrx23، با روش جهش‌زايي هدايتشده Cys11باُSer جايگزين شد. پروتيين جهش‌يافته (C11SOsTrx23) و طبيعي (WtOsTrx23) در باكتري اشريشياكلي سويه روزتا به صورت دگرساخت بيان و خالصسازي شدند و فعاليت احيايي آنزيم‌هاي طبيعي و جهش‌يافته در واكنش با انسولين بررسي شد. همچنين دايمر و مونومر بودن اين پروتيين ها از طريق ران كردن آنها در دو شرايط احيا و عدم احيا بر روي ژل SDS-PAGE مورد بررسي قرار گرفت. بر اساس نتايج به دست آمده سيستيين انتهايي درOsTrx23، با ايجاد پيوند ديسولفيدي نقش كليدي در دايمرشدن پروتيين دارد اما تاثيري بر فعاليت احيايي ندارد.

Thioredoxins (Trxs) are low-molecular-mass proteins with two cysteins in their active site WC(G/P)PC which are involved in reversible reduction of disulfide bonds. In contrast to animals and prokaryotes that typically possess one or a few genes encoding Trxs, higher plants contain eight different Trx types: f, m, x, y, z, o, s, and h. The cytoplasmic type Trxs (h- type) constitute a particularly large subgroup in higher plans. For instance, in the genome of rice (Oryza sativa), nine genes encoding putative Trx h were identified. Among these nine isoforms OsTrx20, OsTrx1, OsTrx18 and OsTrx23 have additional cys residue in N-terminal in comparison to the other OsTrxh isoforms. In order to study the critical role of this cysteine in OsTrx23, we replaced it with serine using site-directed mutagenesis. Both wild type and mutant proteins were heterologously expressed in Rosetta (DE3)- a strain of Escherichia coli-. The purification of these proteins enabled us to compare their activity in reaction with insulin as substrate. In addition, the dimerization of proteins were analysed under non- reducingand reducing condition with DTT. The results shows that whereas wild type OsTrx23 is present in monomer and dimer forms, the mutant OsTrx23(C11S) is dominantly in monomer form. The activity of mutant was almost similar to wild type. These results suggest that Cys11 at the N-terminal of OsTrx23 has a key role in dimerization of this protein by creating disulfide bonds.