جداسازي، بيان ژن و توليد پروتيين افكتور PthA باكتري Xanthomonas citri subsp citri عامل بيماري شانكر مركبات

Isolation, gene expression and PthA effector protein production of Xanthomonas citri subsp citri causal agent of citrus bacterial canker

بيماري شانكر باكتريايي مركبات از جمله مهمترين بيماري هاي باغات ليموي مكزيكي در جنوب كشور مي باشد كه توسط باكتري Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ايجاد مي‌شود. پروتيين PthA باكتري عامل شانكر مركبات، به عنوان پروتيين افكتور، نقش اساسي در فرايند بيماري زايي دارد و لذا غير فعال سازي آن با استفاده از آنتي بادي مي تواند منجر به ايجاد مقاومت بر عليه بيماري شود. در اين تحقيق جداسازي و بيان ژن pthA و خالص سازي پروتيين حاصل از آن صورت پذيرفته است. براي اين منظور با استفاده از منابع اطلاعاتي بانك ژن، آغازگرهاي اختصاصي براي جداسازي ژن pthA طراحي شد و سپس قطعه ژني مربوطه در ناقلpTZ57R/T همسانه سازي گرديد. ژن مزبور سپس به صورت متصل به دنباله شش تايي هيستيدين در ناقل بياني باكتريايي pET28a همسانه سازي گرديده و بيان آن به صورت نوتركيب در سويه BL21(DE3) باكتري Escherichia coli صورت پذيرفت. خالص سازي پروتيين نوتركيب PthA در شرايط طبيعي غير واسرشتي و با استفاده از روش كروماتوگرافي تمايلي بر روي ستون نيكل صورت پذيرفت. صحت بيان پروتيين مذكور با روش هاي الكتروفورز پروتيين و وسترن بلاتينگ با استفاده از آنتي بادي هاي اختصاصي توالي شش تايي هيستيدين مورد بررسي و تاييد قرار گرفت. پروتيين نوتركيب خالص بدست آمده مي تواند به عنوان آنتي ژن براي توليد آنتي بادي هاي نوتركيب مونوكلونال مورد استفاده قرار گيرد.

The citrus bacterial canker is among the most important diseases in Mexican lime gardens in southern area of Iran. The disease is caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). The PthA bacterial protein, as an effector protein, is crucial in pathogenesis pathway. Inhibition of its functions through antibody could lead to suppression of disease in plant. The present study was performed for isolation and expression of pthA gene and purification of PthA recombinant protein. For this aim the specific primers were designed for isolation of 606 bp of hydroxyl terminal of this gene followed by PCR amplification and cloning into pTZ57R/T vector. The coding sequence of truncated pthA was inserted to pET28a bacterial expression vector as a C-terminal fusion to 6XHis tag. Production of recombinant protein was performed in BL21(DE3) strain of E. coli. The purification was done under native condition through affinity chromatography on nickel column. Total yield was assessed by SDS-PAGE and western blotting analysis. The results confirmed production of PthA recombinant protein with molecular weight around 26 kDa. The purified recombinant protein could be used as an antigen for production of recombinant monoclonal antibodies.