توليد آنزيم لوسيفراز ايراني جهش‌يافته به روش SDM با كاربرد تشخيص باليني

Production of a Mutated Iranian Luciferase by SDM for Using in Medical Diagnostic Assays

مقدمه: آنزيمي كه واكنش بيولومينسانس يا نشر نور را در تعدادي از موجودات كاتاليز مي‌كند لوسيفراز نام دارد. از واكنش كاتاليز شده توسط اين آنزيم مي‌توان در بسياري از سنجش‌هاي تشخيص طبي ازجمله سنجش مقدار ATP در محيط، كيت‌هاي تشخيصي بر پايه لوسيفراز، تعيين مقدار آلودگي ميكروبي در يك محيط، ساخت بيوسنسورها و گزارشگرهاي زيستي استفاده نمود. در جهت پايدارسازي آنزيم با كمك روش جهش‌زايي هدف‌دار، لوسيفراز هاي نوتركيب مختلفي ساخته‌شده‌اند. يكي از اين آنزيم‌ها با جهش L300R بر جهش‌يافته ERR (E354RR356) لوسيفراز ايراني L.turkestanicus به‎دست آمد كه جهش‌يافته LRR (ERR/L300R) نام‌گذاري شد. اين آنزيم اگرچه نسبت به آنزيم طبيعي به حرارت مقاوم‌تر بود، اما تقريباً غيرفعال بود. هدف از انجام اين تحقيق ارزيابي امكان فعال‌سازي مجدد آنزيم غيرفعال شده LRR با كمك روش جهش‌زايي هدف‌دار جهت استفاده از آنزيم‌هاي جهش‌يافته در ساخت كيت‌هاي سنجش ATP و ديگر آزمايش‌هاي زيستي بوده است. مواد و روش‌ها: در اين تحقيق با روش جهش‌زايي هدف‌دار اسيدآمينه گلوتامات 270 در آنزيم LRR به آلانين تبديل شد. سپس مطالعات سينتيكي آنزيم انجام شد و خصوصيات ساختاري جهش‌يافته فوق نيز به‌وسيله تكنيك‌هاي فلورسنت و CD بررسي گرديد. يافته‌ها: نتايج بررسي‌هاي سينتيكي نشان داد كه آنزيم جهش‌يافته 270 فعال‌تر از LRR مي‌باشد. همچنين مطالعات ساختاري نشان داد كه آنزيم فوق هم از لحاظ ساختارهاي دوم و هم ساختار سوم پروتيين، تغييرات عمده‌اي نموده است. نتيجه‌گيري: با جهشي كه در جهش‌يافته 270 اعمال و سبب فعال‌تر شدن نسبي آن در مقايسه با LRR شد، پيشنهاد مي‌شود بتوان از آنزيم 270 در ساخت كيت‌هاي سنجش باليني استفاده نمود.

Background: In the bioluminescence phenomenon which has been observed in many organisms, a luciferase catalyzes the oxidation of luciferin to oxyluciferin and a visible light is produced. Light production of luciferase is one of the most sensitive tools in the detection of ATP for measuring microbial contamination, study of protein-protein interactions in cells and construction of biosensors and genetic bioreporters. In spite of these applications, the weakness of firefly luciferase is its rapid inactivation. Many studies have been done to develop thermostable luciferases by site directed mutagenesis. One of these modifications was LRR mutant in which the Leu300 was substituted with Arg in the E354RR356 Lampyris turkestanicus luciferase as template. LRR was more thermostable than the wild-type but with only 0.02% activity. Materials and Methods: In this research by using the method of site-directed mutagenesis, glutamate 270 was substituted with alanine in LRR mutant as template. The kinetics parameters of the mutated enzyme were determined and its structural characteristics were also investigated with fluorescence and CD spectroscopy. Results: The kinetics results revealed that the mutant 270 was more active than LRR. Furthermore the structural studies showed the significant changes in secondary and tertiary structures in the mutated enzyme in comparison with LRR and wild-type samples. Conclusion: The 270 mutant was more active than the LRR and it is recommended that this mutant be used in medical assays kits production.