تكثير ژن فيلياي گاوي غني از GC به كمك بهينه سازي طراحي آغازگر

Amplification of Filia, a Bovine GC Rich Gene, by Optimization of Primer Design

فيليا ژني با اثرات مادري است و اختلال در كاركرد آن در موش منجر به كاهش باروري، و در انسان باعث سقط جنين مي گردد. بررسي توالي رونوشت فيليا در گاو در NCBI نشان مي دهد كه نسبت به اورتولوگ انسان و موش داراي درصد GC بالاتري است. اين امر منجر به اختلال در تكثير ژن در طي سيكل تكثير PCR مي گردد. مطالعه ي حاضر به منظور بررسي امكان تكثير بخشي از رونوشت فيلياي گاوي با درصد بالاي GC با بهينه سازي در طراحي آغازگر به اجرا درآمد. آغازگرها براي دو قطعه ي 443 و 230 جفت بازي از ژن مذكور طراحي شد به صورتي كه فقط براي قطعه ي اول، دو شرط دماي ذوب بالا و اختلاف اندك دماي ذوب آغازگرها در نظر گرفته شد. بررسي بيوانفورماتيك از نظر وضعيت GC و ساختارهاي ثانويه ي احتمالي اين قطعات صورت گرفت. استخراج RNA از تخمك هاي جداشده از تخمدان هاي گاوي انجام گرفت. پس از واكنش رونويسي معكوس، واكنش PCR با دماهاي اتصال مختلف به صورت دو و سه مرحله اي صورت گرفت. نتايج نشان داد كه قطعه ي 443 جفت بازي داراي يك جزيره ي CpG و درصد GC بيشتر و قابليت تشكيل ساختارهاي ثانويه ي پيچيده تري نسبت به قطعه-ي 230 جفت بازي است. با اين وجود تنها قطعه ي 443 جفت بازي كه داراي آغازگرهاي با ويژگي-هاي موردنظر بود، با باند مشخصي تكثير گرديد. نتايج نشان داد اختلاف اندك دماي ذوب آغازگرها، بالا بودن دماي اتصال آن ها و دومرحله اي شدن واكنش مي تواند در تكثير اختصاصي توالي هاي غني از GC موثر باشد.

Filia is a maternal effect gene, disorder in which causes decreased fertility in mouse and abortion in human. Bovine Filia transcript is predicted in NCBI database. Nucleotide analysis shows that it has a higher GC content in comparison with its mouse or human orthologs, and this can make problems in PCR amplification. This study was performed to investigate the possibility of amplification of bovine Filia transcript with high GC content by optimization of primer design. Two pairs of primers were designed to amplify 443 and 230 bp fragments. High Tm of primers and low ?Tm conditions were considered to design only the first pair of primers. Bioinformatic analysis was performed on the two fragments to analyze the GC contents and possible secondary structures. RNA was extracted from bovine oocytes. After reverse transcription, PCR amplification was performed with different annealing temperatures in two or three steps. Results showed that the 443 bp fragment has a CpG island and a higher GC content and more possibility of secondary structure formation compared with the 230 bp fragment. Nevertheless only the 443 bp fragment with the primers of interest was amplified with a sharp band. In conclusion we showed that low ?Tm, high Tm of primers and annealing temperatures and also a two-step PCR help specific amplification of GC-rich sequences.