توليد پروتيين دوگانه EspA- Tirاز باكتري اشريشيا كلي O157:H7 در گياه توتون (Nicotiana tobbacum)

Production of Bivalent Protein EspA-Tir from Escherichia coli O157: H7in Tobacco (Nicotiana tobbacum

باكتري E.coli O157:H7 يك پاتوژن مهم انسان و حيوان است كه در انسان موجب بروز اسهال خونريزي دهنده و سندرم اورمي همولتيك (HUS) مي شود. اتصال به سلول هاي ميزبان اولين گام در تثبيت اين باكتري است كه به‌واسطه سيستم ترشحي نوع III (T3SS) و از طريق ميانكش بين پروتيين هاي ترشحي صورت مي گيرد. در اين ميان EspA به‌عنوان جز اصلي تشكيل‌دهنده سيستم ترشحي است و ارتباط تنگاتنگي با اتصال اوليه باكتري به سلول ميزبان و تشكيل بيوفيلم باكتريايي دارد. EspA به سبب ساختار خود و قرارگرفتن در غشا باكتري، يك ايمني زاي قوي مي باشد. Tir نيز پروتييني است كه پس از بيان در باكتري و از طريق T3SS به سلول ميزبان منتقل و در غشا آن مستقر مي شود و نقش مهمي در اتصال باكتري به ميزبان دارد. هدف از اين تحقيق ساخت سازه ژني كه داراي فاكتورهاي فوق الذكر (EspA-Tir) بوده و انتقال آن به درون گياه هدف مي‌باشد. در راستاي ساخت واكسن خوراكي كارا بر عليه باكتري اشريشيا كلي O157:H7. پس از بررسي هاي بيوانفورماتيكي سازه ژني دو قسمتي و espA-tir توسط رابط جداكننده پپتيدي به يكديگر متصل و ژن آن‌ها به‌طور مصنوعي ساخته شد. پس از بهينه‌سازي كدون‏ها براساس گياه تنباكو، تحت كنترل پروموتر CaMV35S در ناقل بياني گياه كلون گرديد. سپس تراريختي و باز‏زايي گياه تنباكو با آن انجام گرفت. آناليز هاي انجام‌شده مشخص كرد كه ژن‌هاي مربوطه در گياه موردنظر وارد و بيان مي گردد.

E. coli O157:H7 is an important zoonotic pathogen that causing severe gastrointestinal disease such as hemorrhagic diarrhea and hemolytic uremic syndrome. The first step of bacterial pathogenicity is, attaching to the host cell. EspA is a protein molecule and forms as filamentous structure that is transiently expressed on the outer membrane surface and interacts with the host cell during the early stage adhesion and forms bacterial biofilm, this filamentous structure make it a strong immunogenic. Tir is bacterial protein that translocated to host cell after expression in the bacteria by type III secretion system (T3SS) and integrated in to host cell membrane. Intimin can attach to the host cell by conducting to Tir. The purpose of this study is constructing bivalent gen which contains virulence factor mention before and transferring in to target plant in order to production edible vaccine against E. coli O157:H7.After bioinformatics investigation the two bivalent gen construction (espA-Tir,) were attached by peptide linker, and the gens were constructed. After codon optimization based on tobacco; construction was cloned in expression vector which contains CaMV35s promoter. After transformation and regeneration, the expressions of transgenes were showed in analysis.