مطالعه افزايش بيان ژن فعال كننده پلاسمينوژن بافتي با استفاده از روش سركوبي خاموشي ژن به كمك پروتيين P19

Enhanced expression of tissue plasminogen activator via gene silencing suppressor strategy using P19 protein

پروتيين فعال كننده پلاسمينوژن بافتي(tissue plasminogen activator) انسان يكي از مهم ترين پروتيين هاي دارويي در درمان سكته است كه در تجزيه لخته خون در مغز و رگ هاي خوني قلب دخالت دارد. بدين منظور روش هاي جديد موجود در بيوتكنولوژي كشاورزي همچون انتقال ژن به هسته وكلروپلاست براي توليد اين پروتيين ارزشمند به كار گرفته شد. بيان موقت ژن در گياهان، روشي سريع، قابل انعطاف و تكرار پذير جهت توليد ميزان بالاي پروتيين هاي دارويي ارزشمند است. مشخص شده است كه خاموشي پس از رونويسي بر ميزان بيان تاثير مي گذارد. بنابراين، اثر بيان همزمان ژن سركوب-كننده خاموشي ژن P19، كه توالي كد كننده آن از ويروس كوتولگي بوته انبوه گوجه فرنگي به دست آمده است، بر روي بيان موقت tPA در گياه توتون (Nicotiana tabacum) واريته Xanthi مطالعه شد. براي اين منظور، ميزان بيان در تزريق آگروباكتريوم حاوي ناقل دوتايي بياني pTRAc-tPA-ERH به همراه اگروباكتريوم حاوي ناقل pCAMBIA-P19 در مقايسه با ميزان بيان بدست آمده از آگروباكتريوم تنها حاوي ناقل دوتايي بياني pTRAc-tPA-ERH مورد بررسي قرار گرفت. نتايج بدست آمده از تزريق همزمان براساس آزمون الايزا (ELISA) نشان داد كه ميزان بيان tPA با استفاده از P19، ?g/g 10 وزن تر برگ بود كه اين ميزان بيان، حدود دو برابر زماني بود كه در تزريق از اگروباكتريوم حاوي ناقل P19 استفاده نشد. بنابراين در مقايسه با انتقال پايدار كه به مدت زمان بيشتري براي توليد پروتيين موردنظر نياز است، در انتقال موقت به ازا تعداد برگ هاي قابل تزريق يك گياه و توليد?g 10 tPA در ازا هر گرم وزن تر برگ مي توان به ميزان بيشتري از اين پروتيين در مدت زمان كمتر از يك هفته دست يافت. در نتيجه، بنظر مي رسد استفاده از بيان موقت براي بيان tPA مفيد است و سطح بيان با بكارگيري سركوب-كننده خاموشي ژن كد شده توسط ويروس بهبود يافته است و به ميزان بيان ?g/g 10 وزن تر برگ رسيده است.

Human tissue-type plasminogen activator (tPA) is one of the most important therapeutically proteins involved in the breakdown of blood clots of brain and heart blood vessels following stroke. Therefore, several modern approaches in plant biotechnology such as nuclear and chloroplast transformation have been used to produce the valuable protein. Plant transient expression is a rapid, ?exible and reproducible approach to obtain high-level of expression of valuable recombinant pharmaceutical proteins. It is shown that post-transcriptional gene silencing (PTGS) process influences the expression level. Therefore, the effect of co-expression of gene silencing suppressor gene P19, derived from tomato bushy stunt virus (TBSV), has been studied on transient expression of tPA in Nicotiana tabacum cv. Xanthi. To serve this purpose, the expression proportion of injected Agrobacterium tumefaciens containing a binary vector pTRAc-tPA-ERH with Agrobacterium containing pCambia-P19 have been studied comparison with the expression level from Agrobacterium containing only the binary vector pTRAc-tPA-ERH. ELISA results from co-agroinjection experiments have shown that the expression level of tPA using p19 was 10?g/g of leaf fresh weight, which this expression level was about two times more than that from leaves injected with Agrobacterium without the vector harboring p19. Therefore, comparing to the stable transformation which needs more time to produce the protein, in transient expression, depends on the number of the injectable leaves per plant and production of 10?g of tPA per gram leaf fresh weight, a higher level of expression can be achieved less than one week. In conclusion, it seems transient expression could be utilized to express tPA usefully and the expression level could ameliorate using virus coded gene silencing suppressor to achieve the expression proportion of 10?g/g of leaf fresh weight.