ساب كلونينگ ژن NGF در وكتورترشحي pSecTag2/Hygro و بيان آن در سلول‌هاي ردۀ PC12

Subcloning of NGF Gene into pSecTag2/Hygro Secretory Vector and Expression in PC12 Cell Line

مقدمه: ساب كلونینگ ژن‌های اختصاصی در پلاسمیدها و انتقال آن‌ها به سلول‌های هدف به منظور تولید پروتئین‌های درمانی یا تمایز سلول به عنوان یكی از مؤثرترین روش‌های درمان برای بیماری‌های مختلف پیشنهاد می‌شود. فاكتور رشد عصب (NGF) یكی از اعضای خانواده نوروتروفین‌ها است. نوروتروفین‌ها خانواده‌ای از پروتئین‌ها هستند كه میزان بقاء، تمایز و عملكرد انواع مختلف نورون‌ها را تنظیم می‌كنند. مطالعات نشان دادندكه بیان ژن NGF در سلول‌های بنیادی موجب القای تمایز به سمت سلول‌های شبه نورون و رشد آكسون و شاخه‌های آن می‌گردد. مواد و روش‌ها: در این تحقیق هضم آنزیمی بر روی یك پلاسمید حامل ژن NGF انجام گردید و این ژن استخراج شد. ژن NGF در پلاسمید ترشحی pSecTag2 ساب كلون گردید. پلاسمید ساب كلون شده رسوب‌گیری و تغلیظ گردید. سپس با استفاده از لیپوفكتامین به داخل سلول‌های ردۀ PC12 ترانسفكت شد. بیان ژن NGF و تولید پروتئین آن با استفاده از روش‌های RT-PCR و وسترن بلات ارزیابی گردید. یافته‌ها: تعیین توالی نشان داد كه فرایند ساب كلونینگ پلاسمید ترشحی درست بوده است. بیان ژن NGF در سلول‌های ترانسفكت شده PC12 به وسیلۀ روش RT-PCR نشان داده شد و تولید پروتئین آن در نتایج وسترن بلات اثبات شد. نتیجه گیری: ساب كلونینگ ژن NGF بر روی وكتور ترشحی pSecTag2 یك روش مناسب جهت انتقال به سلول‌های یوكاریوتی می‌باشد.

Introduction: Subcloning of specific genes in plasmids and transfecting them into target cells for producing therapeutic proteins or cell differentiation, is suggested as one of the most effective treatment methods for different diseases. Nerve growth factor (NGF) is one of the members of the neurotrophin family. Neurotrophins are a family of proteins that regulate the survival, differentiation, and function of different types of neurons. Studies showed that NGF gene expression in stem cells induces differentiation toward neuron-like cells as well as the growth of axons and its branching. Materials and Methods: In this research, enzymatic digestion on a plasmid carrying NGF gene was performed and extracted. NGF gene was subcloned into pSecTag2/Hygro secretory plasmid. The subcloned plasmid was precipitated and concentrated. It was then transfected by Lipofectamine into PC12 cell line. NGF gene expression and protein production were evaluated using RT-PCR and western blot methods. Results: Sequence determination indicated that secretory plasmid subcloning process has been correct. Expression of NGF gene in transfected PC12 cells was shown by RT-PCR method and production of its protein was proved by the results from western blots. Conclusion: Subcloning of NGF gene in pSecTag2 secretory vector is a suitable technique for transfer to eukaryotic cells.