شناسايي عامل شانكر باكتريايي درختان فندق در استان گيلان

Identification of the causal agent of bacterial canker on hazelnut trees in Guilan province

تا‌كنون دو گونه از باكتریهای جنس Pseudomonas، شامل P. avellanae و P. syringae pv. syringae به عنوان مولد بیماری شانكر باكتریایی و عامل زوال و خشكیدگی درختان فندق (Corylus avellana) شناسایی شده‌اند. علائم عمده بیماری ایجاد شده توسط P. avellanaeشامل پژمردگی سریع جوانه‌ها، سرشاخه‌ها و شاخه‌های درختان طی بهار و تابستان می‌باشد. برگها پژمرده و خشكیده شده و تا مدتها پس از خشكیده شدن متصل به ساقه باقی می‌مانند (Scortichini & Mehlenbacher, 2001). پوست و كامبیوم درختان بیمار تغییر رنگ داده، ریشه‌های اولیه نكروز شده و در نهایت منجر به مرگ گیاه می‌شود (Scortichini & Tropiano, 1994). گیاهانی كه مورد حمله P. avellanae قرار گرفته‌اند در فاصله چند هفته كاملا پژمرده، به سرعت خشكیده شده و می‌میرند. به همین دلیل بیماری ناشی از این باكتری را مرگ درختان فندق نامیده اند (Scortichini, 1999). علائم ایجاد شده بوسیله P. syringae pv. syringae خفیف‌تر بوده و حالت پژمردگی سریع و مرگ درختان فندق در اثر این باكتری مشاهده نشده است (Scortichini, 2002). در ایران مطالعات مختصری در زمینه شناسایی و بررسی باكتریهای بیماری‌زای فندق انجام شده است و تنها گزارش مرتبط با باكتریهای Psudomonas بیماریزای فندق، جداسازی باكتری P.syringae از درختان فندق منطقه دوهزار تنكابن است كه حسن زاده و مهدویان از درختان فندق این منطقه كه علائم زردی، پژمردگی و تغییر رنگ آوندی را از خود نشان می‌دادند، باكتری P.syringae را جداسازی و شناسایی نمودند (حسن زاده و مهدویان،1377). با توجه به خسارت‌زا بودن باكتریهای Pseudomonas روی درختان فندق و عدم انجام مطالعه روی این باكتریهای بیماری‌زا در گیلان، طی سال 1383 درختان فندق مناطق مختلف استان گیلان بازدید شده و از درختان دارای علائم مشكوك نمونه‌برداری گردید. پس از كشت عصاره بافت‌های آلوده روی محیط‌كشت‌های NA و Kingʹs B كلنی‌هایی كرم‌رنگ و دارای حالت فلورسانت جداسازی شدند. جدایه‌ها گرم منفی، لوان مثبت، اكسیداز و پكتیناز منفی، كاتالاز مثبت و هوازی اجباری بوده، روی برگ توتون واكنش فوق حساسیت ایجاد كرده و قادر به هیدرولیز ژلاتین نبودند. بر اساس این خصوصیات، جدایه‌ها به عنوان جنس Pseudomonas شناسایی شدند. برای انجام آزمون تولید سیرینگومایسین از قارچ Geotrichum candidum استفاده شد (Young et al., 1992). جدایه‌ها دارای قابلیت ایجاد هسته یخ و تولید سیرینگومایسین بودند ولی قادر به تولید ایندول، احیاء نیترات، تولید H2S، تحمل نمك طعام 7% و هیدرولیز نشاسته نبوده و توین 80 و كازئین را هیدرولیز نمودند. همچنین جدایه‌ها قادر به استفاده از تارتارات، ال- سیستئین، لیزین، لاكتوز، رامنوز، مالتوز، ال-آرابینوز، ریبوز، گلیسین، تریپتوفان و دكسترین نبودند، ولی از دی- سوربیتول، رافینوز، تره‌هالوز و سوكروز استفاده كردند. آزمون بیماری‌زایی جدایه‌ها روی برگ‌ها، میوه‌ها (Yessad et al., 1992) و جوانه‌های سرشاخه فندق (Jones, 1971) نیز مثبت ارزیابی گردید. بر اساس مجموع خصوصیات فیزیولوژیكی و بیوشیمیایی (جدول 1) جدایه‌ها به عنوان P. syringae pv. syringae شناسایی شدند (Schaad, 2001). الكتروفورز پروتئین (SDS-PAGE) با استفاده از روش Laemmli با اندكی تغییرات انجام گرفت (Laemmli, 1970). كلیه جدایه‌ها در الكتروفورز پروتئینی تام سلولی به روش یك‌بعدی در ژل پلی‌اكریل‌آمید 12% نوارهایی تولید نمودند و پروفیل پروتئینی جدایه‌ها با جدایه مرجع این پاتوار دریافت شده از كلكسیون باكتریهای بیماری‌زای فرانسه (CFBP) نیز درصد بالایی از تشابه را میان آنها نشان داد. در این بررسی برای اولین بار بیماری‌زایی این پاتوار روی درختان فندق در استان گیلان گزارش شد. باكتری P. avellanae از هیچ یك از نمونه‌های مشكوك مشاهده شده، جداسازی نشد و وجود آن روی درختان فندق استان به اثبات نرسید.      

Two species of Pseudomonas bacteria including P. avellanae and P. syringae pv. syringae have been identified till now as pathogenic agents on hazelnut trees. During the year 2004, hazelnut trees of Guilan province were visited and samples were taken from trees showing suspicious symptoms. After culturing extracts of the infected tissues on NA and King’s B media, dark white, fluorescent colonies were isolated. The isolates were gram negative, oxidase and pectinase negative, Levan and catalase positive and obligate oxidative. They caused hypersensitive reaction on tobacco leaves and could not hydrolyze gelatin. Based on these characteristics, isolates were identified as the genus Pseudomonas. The isolates had the ability to produce ice nucleation and syringomycin toxon, but they could not produce indole, reduce nitrate, produce H2S, tolerate NaCl 7% and hydrolyze starch, but they hydrolyzed Tween 80 and casein. The isolates also could use tartarate, L-cystein, lysin, lactose, rhamnose, maltose, L-arabinose, ribose, glycin, triptophan and dextrin, but they used D-sorbitol, rafinose, trehalose and sucrose. Pathogenicity test of isolates on leaves, fruit and buds of hazelnut branches was also positive. Based on all physiological and biochemical characteristics, the isolates were identified as P. syringae pv. syringae. Comparison of protein profile of isolates with reference strain of this pathovar also showed a high similarity percentage. Pathogenicity of this pathovar on hazelnut trees in Guilan province was proved for the first time as a result of the current research. P. avellanae was not observed and isolated from any of the suspected samples and existence of it was not proved in this province.