بررسي تاثير استفاده از پپتيد نشانه پروترومبين انساني بر كارآيي ترشح فاكتور 9 انساني در رده سلولي HEK293T

A Study of the Effect of Human Prothrombin’s Signal Peptide on the Secretion Efficiency of Recombinant Human FIX in the HEK293T Cell Line

به‏طور عمده پروتيين‏هاي يوكاريوتي داراي پپتيد نشانه هستند كه نه تنها نقش محوري در كارآيي ترشح دارند بلكه در بيان پروتيين نيز اهميت دارند. فاكتور 9 انعقادي، گليكوپروتييني است كه نقش محوري در مسير انعقاد خون ايفا مي‏كند. نقص يا كاهش توليد فاكتور 9 منجر به بيماري هموفيلي B مي‌شود. در اين پژوهش، با هدف افزايش و كارآيي ترشح پروتيين فاكتور 9، عملكرد پپتيد نشانه پروترومبين انساني در سامانه بياني هترولوگ بررسي شد. به اين منظور، كارآيي ترشح پپتيدهاي نشانه ابتدا با برنامه‌هاي رايانه‌اي SignalP و PrediSi و سپس به‏صورت عملي ارزيابي شد. مواد و روش‌ها: با استفاده از روش‌هاي مولكولي، تكثير پپتيد نشانه پروترومبين انساني و الحاق آن به بخش بالغ cDNA فاكتور 9 انساني انجام شد. سپس قطعه كايمريك حاصل در مقايسه با فاكتور 9 انساني با پپتيد نشانه بومي در رده سلولي HEK293T تحت تنظيم پروموتر سيتومگالوويروس (CMV) در شرايط گذرا به‏طور عملي آزمايش شد. با استفاده از نرم‌افزارهاي پيشگويي كننده مبتني بر الگوريتم شبكه‌هاي عصبي، امتيازي براي جايگاه برش و كارآيي ترشح پپتيد نشانه پروترومبين انساني و بومي فاكتور 9 ارزيابي شد. ميزان فاكتور 9 بيان شده در محيط كشت سلول‌هاي نوتركيب با RT-PCR و الايزا بررسي شد. نتايج: بررسي‌هاي رايانه‌اي پيشگويي نمود كه پپتيد نشانه پروترومبين انساني در مقايسه با پپتيد نشانه بومي فاكتور 9 كارآمدتر است. اين پيشگويي با استفاده از روش‌هاي RT-PCR و الايزا عليه RNA كايمري و نيز پروتيين نوتركيب FIX به‌ترتيب تاييد شد. نتيجه‌گيري: تحقيق حاضر نشان داد كه پپتيد نشانه پروترومبين انساني نسبت به پپتيد نشانه بومي پروتيين فاكتور 9از كارآيي بالا‌تري برخوردار است. اين موضوع با پيش‌بيني‌هاي حاصل از برنامه‌هاي رايانه‌اي مطابقت دارد. نتيجه اين جايگزيني مي‌تواند در فاز بيان پايدار بررسي شود.

: Eukaryotic proteins generally have signal peptides which are not only crucial for their secretion efficiencies but are important for their expression levels. Coagulation factor IX (FIX) is a glycoprotein that plays a fundamental role in the blood coagulation pathway. Reduced levels or dysfunctional FIX are associated with hemophilia B. This study investigates the function of the human prothrombin signal peptide in an attempt to improve the human FIX (hFIX) secretion efficiency in a heterologous expression system. With this aim, we have used the SignalP and PrediSi programs for in silico evaluation of the signal peptide efficiency prior to conducting this experiment. Methods: We used molecular techniques to amplify and join the coding region of the human prothrombin signal peptide to the cDNA of mature hFIX. The chimeric fragment was examined for transient expression in a mammalian cell line (HEK293T) in comparison with the native hFIX, under a CMVp regulation. Using the neural network-based prediction programs, we evaluated the scores for cleavage position and secretion efficiency of the human prothrombin and hFIX signal peptides. The expression efficiencies of hFIX expressed by the recombinant cells were analyzed by RT-PCR and ELISA. Results: In silico analysis more efficiently predicted the human prothrombin signal peptide with a high score compared to the native hFIX signal peptide. This data was confirmed by the RT-PCR and ELISA results obtained from expression analyses at the RNA and protein levels, respectively. Conclusion: The present study showed that the signal peptide derived from the human prothrombin has the potential for efficient secretion of hFIX as evidenced by the results taken from a transient expression system. The results were consistent with in silico analysis. This replacement could be evaluated in a stable state condition.