جداسازي و تخليص آلژينات لياز پايدار حرارتي موثر بر آلژينات Pseudomonas aeruginosa بيمارستاني

Isolation and purification of an effective thermal stable alginate lyase on hospital Pseudomonas aeruginosa alginate

آلژينات ليازباكتريايي آنزيمي پري پلاسمي است كه در توليد و تخريب آلژينات اهميت دارد. خصوصيات اين آنزيم اعم از وزن مولكولي، pI، مقاومت حرارتي، pH و دماي بهينه و تاثير بر آلژينات باكتريايي در سويه هاي يك باكتري هم مي تواند متفاوت مي باشد. در اين مطالعه، به منظور دسترسي به آلژينات ليازي با خصوصيات ويژه و كار آمد در تخريب آلژينات باكتريايي، ازجدايه موكوييدي Pseudomonas aeruginosa به دست آمده از خلط بيمار مبتلا به عفونت ريوي استفاده شد . از آنجايي كه آلژينات لياز در توليد آلژينات نيز نقش دارد لذا اين سويه براي مطالعه انتخاب شد. ابتدا آلژينات لياز با روش شوك حرارتي از فضاي پري پلاسمي استخراج و سپس با استفاده از غلظت مناسب سولفات آمونيوم و كروماتوگرافي تعويض آنيوني خالص شد. فعاليت آنزيم با روش تيوباربيتوريك اسيد تعيين گرديد. وزن مولكولي نسبي اين آنزيم حدودkDa 60 تخمين زده شد. اثر زمان واكنش، pH، غلظت سوبسترا و دما بر فعاليت آلژينات لياز بررسي گرديد. نتايج نشان مي دهد كه آنزيم بهترين فعاليت را در غلظت mg/ml 4/0 از سوبسترا و بعد از 20 دقيقه واكنش در دماي 37 درجه سانتي گراد و 5/8 pH دارد. فعاليت باقيمانده آنزيم بعد از 4 ساعت قرار گرفتن در دماي 80 درجه سانتي گراد، 33/31% تعيين گرديد كه نشان دهنده پايداري دمايي قابل توجه اين آنزيم مي باشد. اين آنزيم توانايي تخريب آلژينات سويهM 8821 P. aeruginosa را دارد كه اين ويژگي همراه با پايداري حرارتي مناسب، آن را گزينه مناسبي براي درمان كمكي در مبارزه با عفونتهاي مقاوم به آنتي بيوتيك P. aeruginosa مي سازد.

The bacterial alginate lyase is a periplasmic enzyme that is important in the production and disruption of alginate. Characterization of this enzyme such as molecular weight, pI, thermal stability, optimum pH and temperature, and effectiveness on bacterial alginate can differ in the strains of a bacterium. In this study, to obtain an alginate lyase containing specific and efficient properties in destroying of bacterial alginate, a mucoid strain of Pseudomonas aeruginosa isolated from patient‘s sputum was used. Since alginate lyase also has a role in alginate production, this strain was selected for this assay. Alginate lyase was extracted from periplasmic space by heat shock method and was purified by using suitable concentration of ammonium sulfate as well anionic exchange chromatography. Subsequently, enzyme activity was assayed by using thiobarbitoric acid method. The relative molecular weight of the enzyme was estimated about 60 kDa. The effect of reaction time and pH, substrate concentration and impact of temperature on alginate lyase activity was surveyed. Results showed that the optimum activity of the enzyme was achieved at 0.4 mg/ml substrate concentration after 20 min in 37?C and pH 8.5. The enzymatic residual activity after 4 hours incubation in 80?C was determined 31.33% that indicated to the spectacular thermal stability of the enzyme. This enzyme has the ability to disrupt the alginate of P. aeruginosa M 8821, and this ability associated with the thermal stability make it an excellent option for adjunctive therapy in the combat against antibiotic-resistant of P. aeruginosa infections.