كلونينگ و بيان ژن كد كننده آنزيم لاكاز از باكتري باسيلوس آنتراسيس سويه QZA2

Cloning and Expression of Laccase Enzyme from B. anthracis strain QZA2

لاكازها به دليل توانايي اكسيداسيون طيف گسترده‌اي از تركيبات فنولي كاربردهاي بيوتكنولوژيكي گوناگوني دارند. در اين مطالعه سويه بومي QZA2 كه از خاكهاي ايران جدا شده است مورد استفاده قرار گرفت. اين سويه بر اساس توالي SrRNA 16داراي بيش ترين شباهت به باكتري باسيلوس آنتراسيس سويه ATCC 14578 بود. ژن كد كننده آنزيم لاكاز از سويه QZA2 به وسيله پرايمرهاي كلونينگ تكثير شد و سپس محصول PCR در ناقل بياني (pET21a) كلون شد و آناليز توالي انجام گرفت. اين ژن سپس در باكتري اشريشيا كلي سويه BL21(DE3) تحت كنترل فاژ T7 بيان شد. ژن مولتي كوپر اكسيداز در سويه QZA2 يك قالب باز خواندن دارد كه داراي 1656 نوكليوتيد بوده و 551 اسيد آمينه را كد مي‌كند و شامل 4 دمين غني از هيستيدين متصل شونده به مس بود. توالي آمينواسيدي مولتي كوپراكسيداز سويه QZA2 داراي 16 درصد همساني به توالي آمينو اسيدي پروتيين CotAدر باكتري باسيلوس سوبتيليس و 57 درصد شباهت را به توالي مولتي كوپر اكسيداز باكتري باسيلوس هالودورانس نشان داد. بيان تحت شرايط ميكروآيروفيليك به منظور دست يابي به مقادير بيشتر پروتيين محلول انجام گرفت. بيان آنزيم با استفاده از سوبستراي معمول لاكاز ABTS سنجيده شد.

Laccases have many biotechnological applications due to their oxidation ability towards a wide range of phenolic compounds. In this study, the strain QZA2 isolated from Iran soils was used. This strain showed high similarity to Bacillus anthracis strain ATCC 14578 according to 16S rRNA gene sequence. Laccase gene was amplified by cloning primers.then PCR product cloned in the expression vector (pET21a) and transferred to BL21(DE3) strain of E. coli under the control phage T7 and sequence analysis carried out. The gene of the QZA2 has an open reading frame composed of 1656 bases, which encodes 551 amino acid residues and contain four histidine rich copper-binding domains. The laccase gene from QZA2 showed 16% similarity with CotA from B. subtilis and 57% similarity with multicopper oxidase B. halodurans . The expression was performed under microaerobic condition in order to obtain high amounts of soluble protein. Biochemical properties were investigated using common laccase substrates ABTS.