بهينه سازي شرايط بيان آنزيم كيتيناز 42 كايمري در ميزبان پروكاريوتي و مقايسه فعاليت آن با آنزيم كيتيناز42

Optimization of chimeric chitinase42 prokaryotic expression and comparison of its chitinase activity with Chit42

آنزيمهاي كايمري از جمله پروتيينهاي مهندسي شده مي باشند كه از تغيير در ساختار آنزيمها به دست مي آيند. آنزيمهاي كيتينازي به دليل توانايي در تجزيه تركيبات كيتيني، در توليد پروتوپلاست قارچي، تبديل زيستي shellfish waste به بخشهاي تك جزيي، توليد اليگوساكاريدها و كنترل قارچهاي بيماريزا حايز اهميت مي باشند. در اين تحقيق پس از تكثير ناحيه (chitin binding domain) ChBD كيتينازB باكتري Serratia marcescens و cDNA ژن كيتيناز42 قارچ Trichoderma atroviride (فاقد ChBD) با استفاده از آغازگرهاي همپوشان، كيتينازكايمري با استفاده از روش SOEing PCR تكثير و در ناقل بياني همسانه سازي شد. سازه بياني نوتركيب حاصل ابتدا به ميزبان بياني پروكاريوتي منتقل و سپس بهينه سازي بيان پروتيين مورد نظر در اين ميزبان، با استفاده از روش تاگوچي انجام شد. اثر عواملي مانند غلظت IPTG، دماي انكوباسيون و مدت زمان انكوباسيون پس از القا ، بر بيان كيتينازكايمري بررسي شد. با توجه به آرايه هاي متعامد تاگوچي در 3 عامل و 4 سطح، 16 آزمايش طراحي شد. پس از انجام اين آزمايشها پروتيين تام از سلول استخراج و در ژل SDS-PAGE مورد بررسي قرار گرفت. نتايج حاصل از SDS-PAGE با استفاده از نرم افزار Total lab كمي شده و سپس با استفاده از برنامه Qualitek-4 تجزيه وتحليل شد. نتايج حاصل نشان داد كه در بين عوامل مختلف، غلظت IPTG بيشترين اثر را بر بيان پروتيين كيتينازكايمري دارد. بهترين شرايط بيان براي پروتيين كيتينازكايمري به ترتيب IPTG با غلظت يك ميلي مولار، دماي 28 درجه سانتي گراد به مدت 16 ساعت به دست آمد.

Chitinases have the ability of chitin digestion that constitutes a main compound of the fungal cell wall, insect exoskeletons, and crustacean shells. Chitinase Chit42 from Trichoderma atroviride PTCC5220 is considered to play an important role in the biocontrol activity of this fungus against phytopathogenic fungi. The Chitin-Binding Domain (ChBD) of Serratia marcescens chitinase B was selected and fused to the fungal chitinase, T. atroviride Chit42 using SOEing PCR with overlapping primers. The chimeric fragment was cloned into prokaryotic expression vector (pET26b+) and transformed to E. coli BL21-DE3. Culture conditions for chimeric enzyme production by E. coli were optimized by Taguchi orthogonal array experimental design methodology. This approach facilitates the study of interaction of a large number of variables spanned by factors and their settings with a small number of experiments leading to considerable saving in time and cost for the process optimization. The objective of the current research was to determine the significant parameters on the production of chimeric chitinase enzyme in the culture. The process variables were IPTG concentration, incubation time, and temperature. The total protein extraction of all experiments were carried out and analyzed by SDS-PAGE, Total lab and Qualitek-4 software. The optimal levels of the different factors for chimeric chitinase production were 1mM IPTG, and 16 hours of incubation time at 28 °C. IPTG concentration was the most important factor in the enzyme production.