انتقال سازه بياني حاوي ژن‌هاي كايمريك IgG1 و Fv1 به رده سلولي تخمدان هامستر در بيان اينفليكسيماب در سيستم بطري ‏هاي غلطان

Transfection of an expressive construct including IgG1 and Fv1 genes in ovary cell line for infliximab expression

زمینه و هدف: اینفلیكسیماب (Infliximab) شكلی از آنتی‏بادی‏های نوتركیب كایمریك می‏باشد كه هدف مناسبی برای مهار فاكتور نكروز توموری آلفا در بیماری‌های التهابی است. پژوهش كنونی با هدف ارزیابی بیان آنتی‏بادی منوكلونال اینفلیكسیماب در مقیاس نیمه‏صنعتی در سلول تخمدان هامستر چینی انجام شد. روش بررسی: این مطالعه با هدف تولید نیمه صنعتی، از بهمن 1393 تا مرداد 1394 در مركز رشد دانشگاه تهران انجام گردید. وكتور حاوی ژن‌های اینفلیكسیماب، به باكتری E.coli انتقال و وجود ناقل پلاسمیدی حاوی ژن برروی ژل 2% آگارز بررسی شد پلاسمید جداسازی و توسط لیپوفكتامین 2000 (Invitrogen, Germany) به سلول تخمدان هامستر چینی ترانسفكت شد. سلول‌ها توسط G-418، دو هفته تیمار و سلول‌های ترانسفكت شده انتخاب شدند. میزان تولید اینفلیكسیماب در كلون‏های انتخابی پس از 48 ساعت با كیت الایزا IgG، مورد سنجش قرار گرفت. كلون با بیان بالا كشت و محصول با ستون افینیتی پروتیین A خالص شد. جهت تایید خلوص، از روش Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) و برای تعیین راندمان تخلیص، از تست الایزا استفاده شد. یافته‌ها: بررسی ژل آگارز، وكتور حاوی ژن را تایید نمود. ارزیابی غلظت اینفلیكسیماب پس از ترانسفكشن با استفاده از تست الایزا IgG در nm 450، بیشترین و كمترین میزان بیان را به‌ترتیب ng/ml 23 و ng/ml 6 نشان داد. در مرحله تخلیص با ستون افینیتی پروتیین A، پیك مربوط به اینفلیكسیماب، در بازه زمانی 7/0 الی 8/0 دقیقه مشاهده و راندمان تخلیص، 70% محاسبه شد و وجود باند‏های 25 و 50 كیلو دالتونی بر روی ژل پس از تخلیص حضور اینفلیكسیماب را تایید نمود. نتیجه‌گیری: در پژوهش كنونی بیان اینفلیكسیماب در مقیاس نیمه‌صنعتی با استفاده از سیستم بطری غلطان با درصد بیان بالا و راندمان تخلیص حدود 70% انجام شد.

Background: Infeliximab is a form of chimeric antibody which neutralizes the most important inflammatory cytokine, TNF-a, in inflammatory disorders. The aim of current study was to pilot expression of chimeric infliximab in Chinese Hamster ovary (CHO) cells. Methods: In this research study, pVITRO2-neo-mcs vector that consist of infliximab light chain and heavy chain was used to transform into the E.coli by CaCl2 method. The plasmid was then purified and transfected to cultured CHO cells by Lipofectamine 2000® (Invitrogen GmbH, Germany). Transfected cells were selected upon G-418 treatment after 2 weeks and the level of expression, based on standard curve, was measured using IgG ELISA kit after 48 hours for each clone. High level expressed clone was then cultured in roller bottles and recombinant chimeric product was purified by protein A affinity chromatography. The purity of the product was analyzed by 10% gel SDS-PAGE from eluted samples. The efficacy of the purification was analyzed by ELISA before and after purification step. This article is a masterʹs student thesis from February 2015 to August 2016 in pharmaceutical technology development center, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran. Results: The purified plasmid was analyzed on 2% agarose gel. After selective pressure of G-418, 10 stable transfect clones were assessed for infliximab secretion by IgG ELISA kit at 450 nm. The maximum and minimum expression which detected by ELISA were 23 ng/ml and 6 ng/ml, respectively. The band width of infliximab fraction during purification procedure was observed at 0.7-0.8 min. The efficiency of the purification by ELISA was 70%. On SDS-PAGE analysis, two bands, 25 and 50 kDa, respect to light and heavy chains of Infliximab, was confirmed the expression of recombinant protein. Conclusion: In the current study, the construct for infliximab monoclonal antibody production was designed using genetic engineering techniques and the expression was confirmed by conventional molecular biology methods. The high yield production was carried out in semi-industrial scale using roller bottles with a 70 percentage of purification efficiency.