بررسي اپرون مصنوعي در باكتري باسيلوس سوبتيليس (Bacillus subtilis) به منظور كنترل رونويسي

Assessment of artificial operon in Bacillus subtilis to control transcription

در اين مطالعه، اپرون مصنوعي gnt با قابليت تنظيم رونويسي برگشتپذير در باكتري باسيلوس سوبتيليس با استفاده از القا ‌كننده گلوكونات ايجاد شد. ابتدا، جهت عدم تاثير پديده بازدارندگي كاتابوليتي كربن بر روي ميزان رونويسي، در ناحيه اتصالي پروتيين كاتابوليتي A در توالي‌هاي creup و credown جهش ايجاد شد. سپس، ژن‌هاي ساختاري اپرون گلوكونات تحت كنترل يك پروموتر مداوم قوي (PrpsO) به منظور تجزيه پذيري مداوم القا ‌كننده گلوكونات قرار گرفتند. از ژن گزارشگر lacZ نيز در پايين دست پروموتر‌هاي gnt جهت ارزيابي كاركرد اپرون مصنوعي استفاده شد. نتايج حاصل از القا ضربه‌اي نشان داد كه آنزيم بتاگالاكتوزيداز در هر يك از سويه‌هاي جهش‌يافته، در زمان صفر يا عدم حضور القا ‌كننده فعاليتي نشان نداد. با اضافه كردن 1 ميلي‌مولار القا ‌كننده، حداكثر فعاليت آنزيم و تجمع متابوليت در 1 ساعت بعد از اضافه شدن القا ‌كننده ديده شد و به دنبال آن با تجزيه القا ‌كننده فعاليت آنزيم متوقف شد. با افزودن 5/2 و 5 ميلي‌مولار گلوكونات به محيط كشت، حداكثر فعاليت آنزيم بتاگالاكتوزيداز به ترتيب در زمانهاي 2h و 4h مشاهده شد. داده‌هاي ما بيانگرصرف زمان طولاني‌تري براي تجزيه القا ‌كننده و به تبع آن روشن ماندن اپرون در مدت زمان بيشتر و توقف رشد سلولي در حضور غلظت‌هاي بيشتري از القا ‌كننده بود. به طور كلي، مي‌توان استفاده از سيستم القا ضربه‌اي و اپرون‌هاي مصنوعي برگشت‌پذير را جهت توليد وسيع متابوليت‌هاي خاص در بازه زماني كوتاهي از رشد باكتري‌ها در مطالعات بعدي پيشنهاد كرد.

In this study, we proposed the artificial operon which is capable of reversible transcriptional regulation control in Bacillus subtilis. Firstly, the creup and credown were mutated to release from CCR phenomenon. Then, the structural genes of gnt operon were placed under the control of constitutively strong promoter to degrade gluconate constitutively. In addition, the reporter gene (lacZ) was introduced under control of gnt promoters to evaluate functionality of the artificial operon. The results of pulse induction system showed no enzyme activity of each strain in the absence of inducer. By addition of 1 mM gluconate, the highest enzyme activity was shown at 1h after addition of inducer, and then the inducer degraded to turn off the operon. The maximum activation of enzyme was observed in 2h and 4h after addition of 2.5 and 5 mM gluconate into culture media, respectively. Our data indicated that the longer degradation of inducer and higher enzyme activity was appeared by more concentration of gluconate as well as growth arrest. It is suggested to use the pulse induction system and reversible artificial operon to achieve huge amount of special metabolite at short period of bacterial growth.