ارتباط بين فعاليت تلومرازي و كينتيك رشد سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي بند ناف انسان

Relationship between the telomerase activity and the growth kinetics of the human umbilical cord derived mesenchymal stem cells

زمینه و هدف: تلومراز با افزودن توالی تكراری به انتهای ´3 كروموزوم نقش بسیار مهمی در حفظ طول تلومر دارد. از طرف دیگر، سلول‌های بنیادی مزانشیمی بند ناف انسانی (hUC-MSCs) قابلیت تمایز به بیشتر رده‌های سلولی مانند سلول‌های عصبی و قلبی را داشته و دچار تغییرات بیولوژیكی در كشت طولانی‌مدت می‌شوند. از این رو انتخاب پاساژ سلولی مناسب می‌تواند در بررسی‌های تكثیر و تمایز سلولی بسیار مهم باشد. هدف از پژوهش كنونی بررسی ارتباط بین فعالیت آنزیم تلومراز در پاساژهای مختلف كشت hUC-MSCs بود. روش بررسی: این مطالعه تجربی از فروردین 1393 تا آذر 1393 در دانشگاه علوم پزشكی اردبیل بر روی نمونه‌های بندناف نوزادان تازه متولد شده در بیمارستان علوی اردبیل انجام شد. قطعات كوچكی از بندناف در محیط كشت DMEM حاوی 20% سرم جنین گاو كشت داده شدند. سپس، hUC-MSC حاصل از پاساژهای یك تا سه برای بررسی زمان دو برابر شدن جمعیت سلولی (PDT) و استخراج پروتیین به‌روش CHAPS انتخاب شدند. در نهایت، فعالیت آنزیم تلومرازی آن‌ها در پاساژهای مختلف با استفاده از روش‌های Telomeric repeat amplification protocol (TRAP) و qRT-TRAP assay بررسی شد. یافته‌ها: PDT در پاساژهای یك تا سه به‌ترتیب 92/1±68/54، 71/1±03/55 و 54/2±41/69 بود. میانگین فعالیت تلومرازی نیز به‌ترتیب 51/0±58/30، 74/0±24/27 و 75/0±13/32 برآورد شد كه افزایش معناداری را در پاساژ دوم نشان داد (021/0P=). نتیجه‌گیری: با رسم منحنی رشد، تعیین PDT و سنجش فعالیت تلومرازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی بند ناف انسانی مشخص شد كه كشت طولانی‌مدت می‌تواند بر فرایند تكثیر سلولی و فعالیت تلومرازی تاثیر بگذارد.

Background: Telomerase as an enzyme with reverse transcriptase activity has an essential role in telomere maintenance by adding a telomere repeat sequence to the 3ʹ end of chromosome and is important for regulating of many processes in embryonic development including cell proliferation and differentiation. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) with a self-renewal capacity are cells that can differentiate into various germ layer derivatives including neural cells and cardiomyocytes, and undergo biological changes during long-term cultivation. Hence, the passage number in which the cells expanded seems to be very important for proliferating and differentiating. This study was aimed at investigating the relationship between the telomerase activity and the growth rate of (hUC-MSCs) at different passages. Methods: This experimental study was performed in Ardabil University of Medical Sciences, Iran, from March 2014 to December 2014. The umbilical cord samples were obtained from full-term neonate hospitalized in Alavi’s Hospital in Ardabil under sterile conditions. The umbilical vessels were clear off and the small pieces of the umbilical cord were cultured in Dulbeccoʹs modified eagleʹs medium (DMEM) supplemented with 20% fetal bovine serum (FBS). Then, the hUC-MSCs were harvested from passage one to three to calculate the population doubling time (PDT) and extract proteins by using CHAPS lysis buffer. Finally, the telomerase activity of the cells at different passages was measured by telomeric repeat amplification protocol (TRAP) and qRT-TRAP assays. Results: The hUC-MSCs population doubling time at passage from 1 to 3 were calculated as the average of 54.68±1.92, 55.03±1.71 and 69.41±2.54 hours, respectively, suggesting the higher cell passage number, the more extended PDT. The threshold cycles (CTs) for the telomerase activity also showed 30.58±0.51, 27.24±0.74 and 32.13±0.75 for the cell passage from one to three, respectively, representing the significant increasing in telomerase activity at passage two compared with the other passages (P= 0.021). Conclusion: Analysis of the growth curve, PDT determination and measurement of telomerase activity of the human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells showed that the long-term cell culture can affect on the cell proliferation and the telomerase activity.