زيرهمسانه‌سازي و بررسي بيان ژن صناعي ناحيه اتصالي نوروتوكسين بوتولينوم تيپ A (BD/A)

Subcloning and Assessment of the Expression of Synthetic Gene of Botulinum Neurotoxin Type A Binding Domain (BD/A)

زمینه و هدف: سندرم بوتولیسم توسط نوروتوكسین باكتری كلستریدیوم بوتولینوم ایجاد می‌شود. این نوروتوكسین دارای 7 سروتیپ از A-G می‌باشد. بهترین روش برای پیشگیری از سندرم حاصل از نوروتوكسین بوتولینوم (BoNT)، استفاده از واكسن‌های نوتركیب ساخته‌شده از ناحیه اتصالی آن (به‌علت داشتن اپی‌توپ‌های كافی برای تحریك سیستم ایمنی) می‌باشد. در این مطالعه ناحیه اتصالی نوروتوكسین بوتولینوم تیپ A (BoNT/A) بررسی گردید روش بررسی: در ابتدا ژن ناحیه BoNT/A از GenBank با شماره دسترسی CP000727.1 تهیه و براساس ترجیح كدونی E. coli، بهینه‌سازی كدون انجام شد. سپس در پلاسمید pET28a، سنتز و بعد از آن در پلاسمید بیانی pGEX-4T-1، زیرهمسانه‌سازی شد. زیرهمسانه‌سازی با استفاده از روش PCR با آنزیم Pfu DNA polymerase و سپس برش دوگانه با آنزیم‌های XmaI و XhoI انجام گرفت. از سویه E. coli BL21 به‌عنوان میزبان برای بیان استفاده شد. ماركر انتخابی برای pGEX-4T-1، آمپی‌سیلین بود. یافته‌ها: روش‌های PCR و برش محدودكننده با آنزیم‌های ذكرشده، زیرهمسانه‌سازی را تأیید كردند. بررسی بیان با استفاده از روش‌های SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ (با استفاده از آنتی‌بادی اسبی ضدBoNT/A)، سپس كروماتوگرافی تمایلی گلوتاتیون انجام گرفت. با اینكه زیرهمسانه‌سازی با موفقیت انجام شد، ولی با به‌كارگرفتن روش‌های ذكرشده، هیچ‌گونه بیان پروتئین مشاهده نشد. نتیجه‌گیری: براساس نتایج این مطالعه، به‌نظر می‌رسد باید میزبان‌های دیگری مانند میزبان‌های یوكاریوتی برای بیان نوتركیب ناحیه اتصالی نوروتوكسین بوتولینوم تیپ A مورد استفاده قرار گیرند.

Background and Objectives: Botulism syndrome is caused by Clostridium botulinum neurotoxin. This neurotoxin has seven serotypes ranging from A to G. The best way to prevent botulism syndrome caused by Botulinum neurotoxin (BoNT), is using recombinant vaccine made from its binding domain (due to having sufficient epitopes to stimulate immune system). In this study, the binding domain of BoNT serotype A (BoNT/A), was investigated. Methods: Initially, BoNT/A gene with accession number CP000727.1, was obtained from GenBank and was codon optimized according to the codon usage of E. coli. Then, the sequence was synthesized in pET28a plasmid and then subcloned in pGEX-4T-1 expression plasmid. The subcloning was done using PCR with Pfu DNA polymerase and then double digestion with XmaI and XhoI restriction enzymes. E. coli BL21 strain was used as the expression host. The selected marker for pGEX-4T-1 was ampicillin. Results: PCR and restriction digestion with the mentioned enzymes confirmed the subcloning process. The assessment of gene expression was performed by SDS-PAGE and western blotting (using horse anti-BoNT/A (and then glutathione affinity chromatography was performed. Although, the subcloning was performed successfully, no protein expression was observed.  Conclusion: According to the findings of this study, it seems that other hosts, such as eukaryotic hosts should be used for recombinant expression of BoNT/A binding domain.