كلونينگ، بيان و تخليص پروتيين نوتركيب فيوژن Tat - Nef ويروس HIV - 1 در سيستم بياني پروكاريوتي

Cloning, Expression and Purification of the Recombinant HIV-1 Tat-Nef Fusion Protein in Prokaryotic Expression System

زمينه و هدف: يكي از پروتيين‌هاي مهم ويروس HIV-1 به نام Nef نقش مهمي در چرخه تكثير ويروس و پيشرفت بيماري ايدز دارد و القاي پاسخ ايمني بر ضد آن مي‌تواند تا حدي عفونت ويروسي را مهار نمايد. به علاوه، بخشي از ناحيه پروتيين فعال كننده رونويسي (Tat، اسيد آمينه‌هاي 48 تا 60) از ويروس HIV توانسته است به عنوان يك پپتيد نفوذ كننده سلولي (CPP) عمل نمايد. در اين تحقيق، براي اولين بار كلونينگ و بيان فيوژن Tat-Nef در باكتري اشرشياكلي صورت گرفت. تاييد بيان پروتيين توسط آناليز وسترن بلات و تخليص آن از طريق روش رنگ آميزي معكوس انجام شد. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه تجربي، ابتدا كلونينگ فيوژن Tat-Nef در وكتور بياني pGEX6p2 صورت گرفت. سپس القاي بيان پروتيين نوتركيب Tat-Nef در باكتري اشرشيا كلي سويه BL21 (DE3) توسط القا كننده IPTG انجام شد. تاييد بيان از طريق تكنيك SDS-PAGE و وسترن بلات با استفاده از آنتي‌بادي منوكلونال ضد Nef صورت گرفت. سپس، تخليص پروتيين فيوژن توسط تكنيك رنگ آميزي معكوس از روي ژل انجام شد. يافته‌ها: نتايج آناليز PCR و هضم آنزيمي، وجود باند واضح حدود 726 جفت باز را روي ژل آگارز تاييد كرد كه نشان‌گر كلونينگ صحيح فيوژن Tat-Nef در وكتور بيان پروكاريوتي pGEX6p2 بود. هم‌چنين، وجود باند پروتييني حدود 54 كيلودالتون روي ژل SDS-PAGE نشان‌گر بيان پروتيين Tat-Nef بود كه توسط آنتي‌بادي منوكلونال ضد Nef در آناليز وسترن بلات تاييد شد. نتيجه‌گيري: پروتيين فيوژن نوتركيب Tat-Nef تخليص شده به عنوان يك آنتي ژن براي طراحي واكسن پروتييني در مقابل عفونت ويروس HIV استفاده خواهد شد.

Background: Nef is one of the HIV-1 critical proteins, because it is essential for viral replication and AIDS disease progression and induction of immune response against it can partially inhibit viral infection. Moreover, a domain of the HIV-1 Trans-Activator of Transcription (Tat, 48-60 aa) could act as a cell penetrating peptide (CPP). In current study, cloning and expression of Tat-Nef fusion protein was performed in E. coli for the first time. The protein expression was confirmed by western blot analysis and was purified using reverse staining method. Materials and Methods: In this experimental study, primarily, cloning of Tat-Nef fusion gene was done in pGEX6p2 expression vector. Then, the expression of Tat-Nef recombinat protein in E.coli BL21 (DE3) strain was performed by using IPTG inducer. The protein expression was confirmed by SDS-PAGE and western blotting using anti-Nef monoclonal antibody. Then, the recombinant fusion protein was purified from gel using reverse staining method. Results: The results of PCR analysis and enzyme digestion showed a clear band of ~ 726 bp in agarose gel indicating the correct Tat-Nef fusion cloning in pGEX6p2 prokaryotic expression vector. In addition, a 54 kDa band of Tat-Nef on SDS-PAGE revealed Tat-Nef protein expression that western blot analysis using anti-Nef monoclonal antibody confirmed it. Conclusion: The purified Tat-Nef recombinant fusion protein will be used as an antigen for protein vaccine design against HIV infection.