انتخاب ژن رفرانس مناسب جهت نرماليزه كردن داده هاي كمّي سنجش ميكرو RNAها در نمونه پلاسماي افراد مبتلا به سرطان معده

To Select the Appropriate Reference Gene for Normalizing the Quantitative Data to Assess MicroRNAs in Plasma Samples of Patients with Gastric Cancer

زمينه و هدف: ميكرو RNAهاي موجود در گردش خون بيوماركرهايي اميدبخش براي تشخيص و ارزيابي بيماران مبتلا به سرطان مي‌باشد. آزمون واكنش زنجيره اي پلي مراز كمي زمان واقعي(RT-qPCR) روشي حساس براي برآورد ميزان بيان ميكرو RNA ها است. با اين وجود، در حال حاضر هيچ توافقي براي انتخاب ژن‌هاي رفرنس مناسب براي آناليزهاي qPCR بر روي ميكرو RNA در گردش خون وجود ندارد. از اين رو، هدف از اين مطالعه انتخاب ژن رفرنس مناسب جهت نرماليزه كردن نتايج RT-qPCR در نمونه‌هاي پلاسماي بيماران مبتلا به سرطان معده بوده است. مواد و روش‌ها: بر اساس مطالعات پيشين سه مولكول SNORD47، U6 و miR-103 به عنوان ژن رفرنس منتخب مورد بررسي قرار گرفتند. بدين ترتيب بعد از استخراج از نمونه‌هاي پلاسماي 40 بيمار مبتلا به سرطان معده و 40 نفر سالم، سطوح بيان اين مولكول‌ها به روش Real-time PCR ارزيابي شد. يافته‌ها: نتايج نشان داد كه تست‌هاي طراحي شده قادر به تشخيص حساس اهداف تعيين شده در يك دامنه خطي مناسب مي‌باشند. بر اساس مقايسه دو گروه افراد بيمار و سالم، اگرچه ميزان بيان مولكول miR-103 بين دو گروه يكسان نبود (017/0p=)، RNAهاي SNORD47 و U6 داراي تغيرات سطوح بياني مشابه بودند. با اين وجود تغييرات در بيان مولكول SNORD47 كمتر از مولكول U6 بود. نتيجه‌گيري: نتايج حاصل از اين مطالعه نشان داد كه مولكول SNORD47 داراي سطوح بياني پايداري در نمونه پلاسماي افراد مبتلا به سرطان معده و افراد سالم است و مي‌تواند به عنوان يك ژن رفرانس مناسب جهت نرماليزه كردن داده‌هاي كمّي تست qPCR مورد استفاده قرار گيرد.

Background: Circulating microRNAs are promising biomarkers in diagnosis and assessment of cancerous patients. Quantitative Real-time PCR assay is a sensitive test for evaluating the levels of miRNAs expression. Nevertheless, there is no concurrence on selecting appropriate reference genes for qPCR analysis of miRNAs in circulation. Therefore, the current study aimed to select a suitable reference gene for normalizing the RT-qPCR assay results in plasma samples of patients with gastric cancer. Materials and Methods: Based on previously published studies, three molecules SNORD47, U6 RNA, and miR-103 were selected as the candidate reference genes. After RNA extraction from plasma samples of 40 patients with gastric cancer and 40 healthy individuals, expression levels of these molecules were evaluated using Real-time PCR method. Results: The results showed that the developed assays are able to diagnose their specified targets by a suitable linear range. By comparing patients and control groups, although the expression levels of miR-103 molecule were not equal between the two groups (p= 0.017), SNORD47 and U6 RNAs had similar expression levels. However, the variations of SNORD47 expression were lower that U6 RNA. Conclusion: Based on the results of the current study, the SNORD47 molecule has a stable expression levels in plasma samples of patients with gastric cancer and normal individuals and can be used as an appropriate reference gene for normalizing the quantitative data of qPCR assay.