بهينه سازي بيان توليد پروتيين نوتركيب PapG.AcmA در ﺳﻮﯾﻪ بياني اﺷﺮﯾﺸﯿﺎ ﮐﻠﯽ

Optimization the expression of PapG.AcmA recombinant protein in Escherichia coli System

سابقه و هدف: اشريشيا كلي يوروپاتوژن (UPEC) يكي از مهمترين باكتري هاي بيماري زاست كه باعث عفونت مجاري ادراري مي شود و هنوز هيچ واكسن انساني عليه آن ساخته نشده است. هدف از اين مطالعه، به?نهسازي بيان پروتيين نوترك?بPapG به همراه پروتيين لنگري لاكتوباسيلوس به نام AcmA در اشريشيا كلي مي باشد. مواد و روشها: ژن كدكننده PapG.AcmA در وكتور كلونينگ pEXA به صورت سنتتيك خريداري و در وكتور بياني pET21a ساب كلون گرديد. ب?ان پروتئ?ن نوتركيب در ميزبان بياني اشريشيا كلي سويه اريگامي با روش SDS-PAGE و وسترن بلات مطالعه شد. توليد پروتيين فيوژن در مقياس بالا تحت تاثير ترك?ب مح?ط كشت، غلظتهاي مختلف IPTG به عنوان القاگر و زمان القا در ب?ان پروتيين نوترك?بPapG.AcmA بهينهسازي گرديد. ?افتهها: با توجه به نتايج بهتر?ن بيان در مقياس بالا، توسط غلظت 0/1 ميلي مولار IPTG در كدورت نوري 3 OD600nm= تعيين شد. مح?ط كشت پ?چ?ده اص?ح شده حاوي گلوكز (6 گرم بر ليتر)، عصاره مخمر (20 گرم بر ليتر)، تريپتون (10 گرم بر ليتر)، KH2PO4 (2/3 گرم بر ليتر) و K2HPO4 (12/5 گرم بر ليتر) به عنوان مح?ط كشت به?نه تع??ن گرد?د. ب?شتر?ن مقدار تول?د ب?ومس و ب?ان پروتئ?ن هدف در مح?ط كشت به?نهسازي شده به م?زان 5/5 OD600nm= تع??ن شد. نت?جهگ?ري: نتايج نشان داد كه كلون سازي و بيان ژن PapG.AcmA قابل انجام مي باشد. همچنين استفاده از منبع كربن گلوكز در ترك?ب مح?ط كشت پ?چ?ده نسبت به مح?ط كشت LB بيان بهتري م?دهد. در نهايت با تخليص و ارزيابي ايمني زايي پروتيين نوتركيب، مي توان از آن به عنوان يك كانديداي واكسن استفاده نمود.

Background & Objectives: Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is one of the most common bacteria to cause urinary tract infection (UTI). No human vaccine against UTI has yet been developed. The aim of this study was to optimize the expression of recombinant PapG with Lactobacillus anchor protein AcmA in E. coli. Materials & Methods: The synthetic cloning vector, pEXA containing PapG.AcmA was purchased and subcloned into pET21a vector. The protein expression levels in Origami expression host (E. coli) were analyzed by SDS-PAGE gel and western blotting. Moreover, various concentrations of IPTG (Isopropyl Thiogalactopyranoside), the medium component and induction time was optimized for large scale expression of recombinant protein. Results: Based on results, optimum expression in large scale was occurred in 0.1mM IPTG and OD= 3 optical density. The modified complex culture medium containing: glucose 6 g/I, K2HPO4 12.5 g/l, KH2PO4 2.3 g/l, Yeast Extract 20 g/l, tryptone 10 g/l were determined as optimal medium. OD 600nm= 3.0 was determined as the best time for induction by IPTG at a concentration of 0.1 mM. The levels of the expression of the target protein was determined at OD600nm= 5.5. Conclusion: Based on the result, we were able to do cloning and expression of PapG.AcmA. Addition of extra carbon source (glucose) to the complex medium caused a better PapG.AcmA recombinant protein expression. Finally, by purification of recombinant protein and evaluation of its immunogenicity, it can be used as a vaccine candidate against the urinary tract infection.