ترانسفكت سلول حشره Sf9 توسط باكولوويروس نوتركيب واجد ژن Core+1 ويروس هپاتيت سي سويهJFH1 ژنوتايپ 2a به منظور بيان اين پروتيين

Transfection of Sf9 insect cells by recombinant Baculovirus containing Core+1 gene of HCV JFH1 genotype 2a in order to express Core+1 protein

سابقه و هدف: در سال هاي اخير پروتيين جديدي بنام Core+1 گزارش شده است كه به وسيله يك تغيير ريبوزومي 1+ در ناحيه كد كننده پروتيين Core ويروس هپاتيت سي HCV)) توليد مي شود. اين مطالعه با هدف طراحي و ساخت وكتور باكولوويروس واجد توالي Core+1 HCV-2a (JFH1) توليد باكولوويروس نوتركيب و تاييد ترانسفكت آن در سلول هاي حشره انجام شد. مواد و روش ها: در اين مطالعه، از ژن Core+1 HCV-2a (JFH1) كه در پلاسميد pUC57 به صورت تجاري سنتز شده بود استفاده گرديد. ژن مورد نظر در پلاسميد pFastBac-HTA همسانه سازي مجدد شد و توسط اين وكتور انتقالي در ميزبان اشريشيا كلي DH10Bac با عمل ترانسپوزيشن، بكميد باكولوويروس نوتركيب به دست آمد. سازه نوتركيب پس از تاييد با واكنش زنجيره اي پلي مراز، براي ساخت با كولوويروس نوتركيب در سلول حشره Sf9 ترانسفكت گرديد. وجود پروتيين نوتركيب Core+1 در سلول حشره با روش SDS-PAGE و وسترن بلات مورد تاييد قرار گرفت. يافته ها: همسانه سازي صحيح ژن 1+Core در وكتور انتقالي pFastBac با استفاده از برش آنزيمي و تعيين توالي تاييد گرديد. واكنش زنجيره اي پلي مراز نشان دهنده صحت طول نواحي تكثير يافته هدف روي بكميد، ايجاد ترانسپوزيشن و نوتركيبي بكميد نوتركيب بود. اثرات سايتوپاتيك سلول Sf9 نشان دهنده ايجاد باكولوويروس نوتركيب بود. پروتيينCore+1 HCV-2a (JFH1) به طور موفقيت آميز بيان گرديد. نتيجه گيري: با طراحي و ساخت وكتور باكولوويروس و توليد باكولوويروس نوتركيب مي توان پروتيين Core+1 مشابه با پروتيين ساخته شده ويروسي را بيان نمود. اين عمل پايه انجام مطالعات آينده خواهد بود.

Background & Objectives: Recently, a new protein, named Core+1, has been reported to be expressed through a +1 ribosomal frame shift in the Core protein coding region of Hepatitis C virus. The purpose of this study was to design a recombinant Baculovirus vector containing HCV-2a (JFH1) Core+1 sequence, and also, to verify the production of this recombinant Core+1 protein in Baculovirus expression system. Materials & Methods: Core+1 gene of HCV-2a (JFH1) was synthesized into pUC57 plasmid. The synthesized target gene was sub-cloned into the plasmid pFastBac-HTA. The recombinant vector was used to transform the competent E. coli DH10Bac containing the donor clone. The recombinant Baculovirus bacmid was produced following transposition. Recombinant bacmid was verified by PCR and then was transfected into Sf9 insect cells to package a new recombinant Baculovirus. SDS-PAGE and Western blotting was used to confirm the expression of Core+1 protein in insect cells. Results: Sequence analysis and white-blue colony selection confirmed a successful cloning of the Core+1 sequence of HCV (JFH1) into the pFastBac-HTA vector and transformation of E. coli DH10Bac. Production of recombinant Baculovirus. The HCV-2a (JFH1) Core+1 protein was successfully expressed and confirmed in SDS-PAGE and Western blot. Conclusions: Baculovirus expression system provides a high yield post-translational modification tool for HCV Core+1 protein expression, which is similar to Core+1 protein produced during natural infection with HCV.