توليد سازه نوتركيب با همسانه سازي ژن دومين 4 آنتي ژن حفاظتي و هم جوشي آن با ژن دومين 1 فاكتور كشنده باسيلوس آنتراسيس در اشرشياكلي

Production of Recombinant Construct by Cloning of Protective Antigen Domain 4 Gene and Fusion of it with Lethal Factor Domain 1 Gene of Bacillus anthracis in E.coli

مقدمه: سياه زخم يك بيماري مشترك بين انسان و دام است. عامل ايجاد كننده اين بيماري مهلك باكتري باسيلوس آنتراسيس مي باشد. در حال حاضر آنتي ژن حفاظتي(PA) به عنوان واكسن موثر سياه زخم مورد استفاده قرار مي گيرد. دومين 4 اين آنتي ژن به همراه دومين 1 فاكتور كشنده(LF)، ايمونوژن هاي قوي اين باكتري بوده و به عنوان كانديد مناسب واكسن عليه آن مطرح مي باشند. هدف ما در اين تحقيق، همسانه سازي ژن دومين 4 آنتي ژن حفاظتي(PAD4) و هم جوشي آن با ژن دومين 1 فاكتور كشنده(LFD1) باكتري، به منظور بررسي توانايي آن ها در القاء ايمني حفاظتي مي باشد. مواد و روش ها: در اين مطالعه تجربي، از يك وكتور pGEMT easy نوتركيب حاوي ژن LFD1 استفاده شد. سپس ژن PAD4 با واكنش آنزيمي PCR تكثير و جداسازي شده و به طور جداگانه در وكتور pGEMT easy ديگري همسانه سازي گرديد. بعد از آن واكنش الحاق ژن PAD4 به ژن LFD1 در وكتور فوق با تعيين جهت گيري LFD1 و توسط جايگاه هاي آنزيمي PstI و XbaI انجام پذيرفت. سازه نوتركيب حاصل از دو ژن فوق در ناقل بياني pET28a به كمك آنزيم هاي محدود الاثر BamHI و XhoI زير همسانه سازي گرديد و پس از تعيين جهت گيري ژن ها، ميزبان بياني BL21 توسط اين ناقل نوتركيب تراريخت گرديد. يافته هاي پژوهش: همسانه سازي اوليه و هم جوشي قطعات ژني PAD4 و LFD1 در ناقل pGEMT easy با موفقيت انجام شد و پس از تاييد فرآيند فوق با دو روش برش آنزيمي و PCR، سازه نوتركيب حاصل با موفقيت در pET28a زير همسانه سازي شد. بحث و نتيجه گيري: با توجه به ايمونوژن بودن نواحي PAD4 و LFD1، بيان پروتيئن اين سازه نوتركيب حاصل از نواحي ژني الحاق شده فوق، مي تواند براي القاء ايمني محافظتي، به عنوان كانديد مناسب واكسن سياه زخم مطرح باشد.

Introduction: Anthrax is a zoonotic disease. Bacterium Bacillus anthracis is the causative agent of the fatal disease. At present, the protective antigen (PA) is used as an effective vaccine against anthrax. Domain 4 of this antigen together with domain 1 of lethal factor (LF) are the potent immunogens of this bacteria and are as suitable candidates of vaccine against it. Our aim in this study is the cloning of protective antigen domain 4 (PAD4) genes and fusion of it with lethal factor domain 1 (LFD1) gene of the bacteria to evaluate their capability in protective immunity induction. Materials methods: In this experimental study, we used a recombinant pGEMT easy vector containing LFD1 gene. Then PAD4 gene was amplified and isolated by PCR and cloned into another pGEMT easy vector, separately. After that, ligation of PAD4 gene and LFD1 gene was done in mentioned vector with determination of LFD1 orientation and by PstI/XbaI restriction sites. The recombinant construct, resulted from these genes was subcloned into pET28a expression vector using BamHI/ XhoI restriction enzymes and after determination of genes orientation, the expression host BL21 was transformed by this recombinant vector. Findings: First cloning and fusion of PAD4 and LFD1 gene fragments were successfully carried out in pGEMT easy vector and after the confirmation of mentioned process by both of enzymatic digestion and PCR methods, the result recombinant construct was subcloned into pET28a. Discussion Conclusions: Since PAD4 and LFD1 are immunogenic regions, expression of the recombinant construct resulted from these ligated genes can be proposed as proper candidate of anthrax vaccine for induction of protective immunity.