اندازه‌گيري كپك آسپرژيلوس نايجر در رب گوجه فرنگي به روش Real Time

Aspergillus niger measurement in tomato paste using Real Time

در اين تحقيق از روش مولكولي Real Time PCR براي اندازه‌گيري كپك آسپرژيلوس نايجر در رب گوجه فرنگي استفاده شد. به دليل مشكلات روش شمارش كپك‌ها به روش Howard Method Count از قبيل احتمال خطاي آزمون كننده، دقت كم و عدم تكرار پذيري، تبيين يك روش استاندارد كه بتواند با دقت و تكرار پذيري بالا تشخيص و شمارش كپك‌ها را امكان پذير سازد ضروري به نظر مي­رسد. روش مولكولي Real Time PCR مي‌تواند به‌عنوان يك روش مناسب براي شناسايي و اندازه­گيري كمي دقيق كپك­ها مطرح باشد كه بر مبناي اندازه­گيري مطلق و نسبي ژن‌هاي كپك­هاي موجود مي باشد. نمونه‌هاي رب گوجه فرنگي با مقادير مختلف اسپور كپك (1^10، 3^10 و 5^10) در هر گرم آلوده شد. پس از گرمخانه گذاري و رشد اسپور كپك و ايجاد ميسيليوم، استخراج DNA از هر نمونه با استفاده از روش al-sammari انجام شد. سپس با استفاده از واكنش Real Time PCR تعداد copy number مربوط به DNA كپك با استفاده از شناساگر سايبرگرين و پرايمرهاي مربوط به جنس آسپرژيلوس نايجر تعيين شد. نتايج نشان داد كه با افزايش مقدار DNA كپك در نمونه‌هاي شاهد و تلقيح شده منحني Real Time در مقادير CT كمتري به فاز لگاريتمي وارد مي شوند. ضريب همبستگي خطي منحني استاندارد در آزمون Real Time 0.938=R^2 بود كه نشان دهنده دقت تعيين كمي اين آزمون مي‌باشد. اختصاصي بودن واكنش با استفاده از منحني ذوب پرايمرها تعيين شد و نشان داد كه واكنش به طور كاملاً اختصاصي انجام شده است.

In this study, molecular method used to measure the Aspergillus niger with Real Time PCR technique in tomato paste. Because of problems mold count method such as proofer error, low and non-repeatability precision, accuracy and repeatability, developing a standard method high accuracy and repeatability and mold counts seems necessary. Real Time PCR molecular method can be used as a suitable method to identify and quantify the precise mold is considered based on the measurement of absolute and relative genes existing molds. Tomato paste samples with different amounts of mold spores (101, 103 and 105) per gram were contaminated. After incubation and growth of spores and mycelium of mold, DNA extraction from each sample was performed using al-sammari method. Then, using Real Time PCR reaction of DNA copy number of molds using SYBR Green reagent and primers of the Aspergillus niger genus was determined. The results showed thatby increasing amount of DNA molds in controls and inoculated samples Real Time curve were entered logarithmic phase in the lower CT values. The correlation coefficient of linear calibration Real Time was R2 = 0/938 which indicates that the accuracy of this test is quantitative detection. The reaction specificity was determined using melting curve of the primers and indicated that the reaction has been completely dedicated.