بيان القايي ژن گزارشگرGFP در رده سلولي LMH با استفاده از ناقلين لنتي ويروسي القا پذير

Inducible Gene Expression of GFP Reporter Gene in LMH Cell Line Using Inducible Lentivirus Vectors

هدف: با تلفيق سيستم االقايي تتراسيكلين (Tetinducible system) و ناقلين لنتي ويروسي، القا بيان ژن گزارشگر Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در سلول‏هاي پرندگان مورد بررسي قرار گرفت. مواد و روش‏ها: ژن EGFP تحت كنترل سيستم‏ TetON قرار گرفت و بيان آن در سلول هاي كبدي جوجه رده LMH بررسي شد. ابتدا باكتري‏هاي مستعد با ناقل لنتي ويروسي القايي حامل EGFP به‏همراه يك ناقل دوم كه فعال كننده Tet (Tettransactivator) به‏نام rtTAM2 را حمل مي‏كرد ترانسفورم شده و ذخيره ماكسي پرپ خالصي از هريك از اين‏دو DNA پلاسميدي فراهم شدند. سپس با روش رسوب DNAفسفات كلسيم سلول‏هاي LMH با ذخيره هردو پلاسميد ترانسفكت شد. در مرحله بعد، غلظت‏هاي سريالي از آنالوگ Tet يعني داكسي سيكلين را به محيط كشت سلول اضافه نموديم به‏‏طوري‏كه با افزايش غلظت DOX، بيان EGFP بيشتر القا گرديد. نتايج: افزايش غلظت داكسي سايكلين افزايش بيان را به دنبال داشت. در 24 ساعت اول بعد از ترانسفكشن بيان به‏ترتيب براي غلظت‏هاي 0 ، 0/01 ، 0/1 و 1 ميكروگرم بر ميلي‏ليتر داكسي سايكلين 0/4، 6/2 ، 10/3 و 16 درصد و در 24 ساعت دوم به‏ترتيب 6/4 ، 26 ، 3/28 و29/2 بود.با اين .جود، افزايش بيش از حد غلظت داكسي سايكلين باعث مرگ سلول­ها گرديد. نتيجه گيري:  تلفيق سيستم‏هاي القايي Tet با منشا باكتريايي و لنتي ويروس‏هاي نوتركيب مرتبط با انتقال ژن به سلول‏هاي انساني مي‏تواند باعث القا ژن در سلول‏هاي پرندگان شود. غلظت القا كننده بر ميزان القا بيان ترانسژن تاثير مستقيم مي‏گذارد.

Aim: By combining Tetinducible system and lentivirus vectors, we investigated the induction of Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) reporter gene in poultry cells. Material and Methods: the EGFP gene was placed under TetON system and its induction was studied in liver cell line LMH. First, we transformed competent bacteria separately with an inducible lentivirus vector carrying EGFP and a second vector carrying Tet transactivator rtTAM2 and prepared a purified maxiprep stock of either plasmid DNA. Then, we used DNAcalcium phosphate coprecipitation method to cotransfect LMH cells with both plasmid stocks. In the next step, we added different concentrations of Tet analog doxycycline (DOX) to cell growth medium. Results: Increase of DOX concentration caused elevation of gene expression Within the first  24  hours after posttransfection, the expression of EGFP for 0, 0.01, 0.1 and 1 µg/ml of DOX was 0.4, 6.2, 10.3 and 16% respectively, and in the next 24 hours the expression changed to 6.4, 26, 28.3 and 29.7% respectively. However, treatment with the overdose of DOX caused the cell death. Conclusions: Combination of Tetinducible system originating from bacteria and recombinant lentivirus vectors designed for gene transfer to human cells can jointly promote transgene expression in poultry cells. The concentration of the inducer can directly influence the level of transgene induction.