پديد آورندگان :
بصيري، محسن نويسنده دانشكده علوم زيستي,گروه ژنتيك,دانشگاه تربيت مدرس,تهران,ايران B, M , بهمنش، مهرداد نويسنده دانشكده علوم زيستي,گروه ژنتيك,دانشگاه تربيت مدرس,تهران,ايران B, M , تهمتني، ياسر نويسنده پژوهشكده زيست شناسي و فناوري سلولهاي بنيادي جهاد دانشگاهي,گروه سلولهاي بنيادي و زيست شناسي تكويني,پژوهشگاه رويان,تهران,ايران T, Y , مرادمند، آزاده نويسنده پژوهشكده زيست شناسي و فناوري سلولهاي بنيادي جهاد دانشگاهي,گروه سلولهاي بنيادي و زيست شناسي تكويني,پژوهشگاه رويان,تهران,ايران M, A , بهاروند، حسين نويسنده پژوهشكده زيست شناسي و فناوري سلولهاي بنيادي جهاد دانشگاهيايران,گروه سلول هاي بنيادي و زيست شناسي تكويني,پژوهشگاه رويان,تهران,ايران B, H
كليدواژه :
لنتي‌ويروس , ناقل ژنتيكي , ترانس‌ژن , سايتومگالوويروس , سلولهاي بنيادي جنيني
چكيده فارسي :
هدف: در اين مطالعه كارايي روش انتقال ژن به روش لنتي‌ويروسي و بيش‌بيان ژن با پروموتر سايتومگالوويروس (CMV) بررسي و تاثير كوچك‌‌مولكول (small molecules) هاي مهاركننده مسيرهاي اپي‌ژنتيكي بر بيش‌بيان ژن ارزيابي شده‌است. مواد و روش‌ها: سلولهاي ES موشي با مقادير مختلف لنتي‌ويروس بيان كننده پروتئين فلورسنت سبز (green fluorescent protein GFP) تراريخت شده و درصد سلولهاي بيان‌كننده GFP با روش فلوسايتومتري اندازه‌گيري شد. ماندگاري بيان GFP در مدت هشت روز بررسي گرديد. به‌كمك لنتي‌ويروس بيان‌كننده ژن فاكتور رونويسي پانكراسي و دئودنومي 1 (Pdx1)، تاثير تيمار كوچك‌مولكول‌هاي 5آزاسايتادين (5AZA)، DZNep و BIX01294 بر سيستم بياني ارزيابي شد. نتايج: انتقال لنتي‌ويروسي ژن به سلولهاي ES با استفاده از ضريب آلوده‌سازي (Multiplicity of infection MOI) 10 و 20 موجب تراريخت شدن بيش از 90 درصد اين سلول‌ها شد. با اين‌حال، بيان ژن انتقال‌يافته در طول هشت روز كاهش چشمگير داشت. كوچك‌‌مولكول 5AZA در محيط كشت تسهيل‌كننده تمايز (permissive)، بيان ژن از سيستم لنتي‌ويروسي را 2/5 برابر افزايش داد. همچنين DZNep در محيط‌هاي پر تواني (pluripotency) و تسهيل‌كننده تمايز موجب افزايش بهترتيب 26/5 و 5/9 برابري بيان ژن شد. بيان ژن Pdx1 داخلي خود سلول نيز در تيمار با DZNep افزايش يافت. نتيجه‌گيري: انتقال لنتي‌ويروسي ژن با MOI بيش از 10، روشي كارآمد براي انتقال ژن به سلولهاي ES موشي است، اما اين روش به‌همراه استفاده از پروموتر CMV موجب خاموش شدن بيان ژن در درازمدت مي‌شود. تيمار با DZNep موجب فعال شدن اين سيستم بياني مي‌شود. اما مي‌تواند با تاثيراتي بر بيان ساير ژن‌هاي سلول نيز همراه باشد.
چكيده لاتين :
Aim: In this study the efficiency of lentiviral gene transfer and cytomegalovirus promoter mediated overexpression has been investigated. Furthermore, the effect of small moleculemediated inhibition of epigenetic pathways on gene overexpression has been studied. Materials and Methods: Mouse ES cells were transduced with different doses of lentiviruses harboring Green Fluorescent Protein (GFP) and the percentage of GFP expressing cells was quantified with flowcytometery. The persistence of GFP expression was assessed after 8 days of transduction. Using embryonic stem (ES) cells transduced with a lentiviral vector harboring pancreatic and duodenal 1 (Pdx1) gene, we studied the influence of 5azacytidin (5AZA), DZNep, and BIX01294 small molecules on the gene expression system. Results: Lentiviral mediated gene transfer to ES cells with 10 and 20 multiplicities of infection (MOI) resulted in more than 90 percent transgenesis. However, the expression of transgene showed a dramatic decrease during 8 days of posttransduction. Treatment with 5AZA leads to a 2.5 folds increase in the transgene expression in a permissive culture medium. DZNep also elevated the transgene expression up to 26.5 and 5.9 folds in pluripotency and permissive media respectively. The expression of endogenous Pdx1 gene also increased following DZNep treated. Conclusion: Lentiviral transduction with MOIs more than 10, is an efficient method for transgenesis of mouse ES cells. However, coapplication of this method along with the CMV promoter leads to inactivation of the gene expression in long term. DZNep treatment results in reactivation of transgene expression but also can influence the expression of endogenous genes.
