مهار موقت بيان ژن VEGFR2 با استفاده از siRNA اختصاصي در محيط كشت

In-vitro Knock Down of VEGFR2 Expression Using Specific siRNA in the Culture Medium

مقدمه: استفاده از siRNA براي خاموش‌سازي بيان ژن‌ها امروزه در حال گسترش است. از جمله اهداف اين تكنولوژي؛ جلوگيري از بيان عامل رشد اندوتليال عروقي است. مطالعه حاضر به‌منظور جلوگيري بيان گيرنده تيپ II اين عامل (VEGFR-2: Vascular Endothelial Growth Factor Receptor II) با استفاده از siRNAي اختصاصي در محيط كشت صورت گرفته است.مواد و روش‌ها: ابتدا با استفاده از توالي ژن هدف، توالي‌هاي siRNAي اختصاصي عليه آن طراحي؛ Blast و ساخته شد. از طرف ديگر cDNA سلول HUVEC سنتز و با كمك پرايمر اختصاصي و PCR به ميزان موردنياز تكثير شد و سپس در وكتور بياني PEFGP-N1 درج و تأييد شد. پلاسميد ناقل حاصله با استفاده از ليپوفكتامين به سلول Hela كه فاقد بيان ژن هدف بود انتقال داده شد. ميزان بيان  GFPدر وكتور اوليه و وكتور تراريخت شده در حضور و عدم حضور siRNA اختصاصي مورد ارزيابي قرار گرفت و ميزان مهار ژن از طريق ارزيابي كاهش فلورسانس سبز رنگ ناشي از GFP و RT-PCR مورد بررسي قرار گرفت.نتايج: نتايج حاصل از دو siRNA به‌كار رفته بيانگر كاهش بيان ژن به‌ترتيب 56% و 62% در مقايسه با گروه كنترل بود (05/0P lt ).نتيجه‌گيري: siRNAي اختصاصي طراحي شده عليه VEGFR-2 با استفاده از ليپوفكتامين به‌طور مناسب به‌داخل سلول منتقل و از بيان گيرنده به‌طور معني‌دار جلوگيري نمود. در واقع با قطع مسير پيام‌رساني رگزايي، مي‌تواند از پيدايش عروق جديد جلوگيري نمايد لذا احتمالاً به‌عنوان يك عامل مناسب درماني جديد در جلوگيري و يا كاهش رگزايي مطرح باشد.

Introduction:The use of siRNAforsilencinggene expressionis expandingtoday. Knock down ofvascular endothelial growth factor is one of theobjectives ofthistechnology. In this study we aimed to inhibit the expression of receptor type II of VEGF (VEGFR-2) using specific siRNA in the culture medium.Methods: First, according to the target gene sequences, sequence of the specific siRNA were designed blasted and built. Using RT-PCR, cDNA of HUVEC was synthesized and PCR with specific primers was reproduced. PEFGP-N1 expression vector was cloned with target gene and confirmed. Then Hela cells which has not any expression of the target genes were transfected whit cloned pEGFP-N1 vector using lipofectamin. GFP expression rate in the Hela cellsContaining initial vector and cloned vector in presence and absence of specific siRNA was assessed. Through evaluation of gene inhibition, decreasing of green fluorescence from GFP, RT-PCR was investigated.Results: The results of the two used siRNA, indicate reduced gene expression 56% and 63% in comparison with the control group (Plt 0.05).Conclusion: Transfection of specific VEGFR-2 siRNA using lipofectamin significantly inhibits expression of receptor. In fact,it cancut thesignal transduction pathwayand preventsthe creation ofnewblood vessels. Therefore, probably it can act as a new treatment factor for prevention or reduction of neovascularization.