همسانه‌سازي ژن آنزيم كلسترول‌ اكسيداز سويه بومي ايراني Rhodococcus sp. 502 در راستاي توليد آفت‌كش بيولوژيكي پنبه

Cloning of cholesterol oxidase gene from Iranian strain of Rhodococcus for production of cotton biological pesticide

آنزيم كلسترول‌اكسيداز به عنوان نسل جديدي از آفت كش هاي بيولوژيك اثر آفت كشي قوي بر روي آفت غوزه پنبه (Heliothis armigera) دارد. مكانيسم اثر كشندگي كلسترول‌اكسيداز مربوط به اكسيداسيون كلسترول در غشاي اپيتيليوم روده مياني حشرات مي‌باشد كه منجر به تخريب فيزيكي و ساختاري غشاء و در نتيجه ايجاد اختلالاتي در عملكرد غشاء و در نهايت سبب مرگ آفت مي‌شود. توليد گياهان مهندسي ژنتيك شده با ژن كدكننده آنزيم كلسترول ‌اكسيداز در جهت مقاوم‌سازي آن ها به آفات، مستلزم انتخاب مناسب‌ترين سوش از نظر ميزان بيان و فعاليت زياد اين آنزيم است. لذا اين تحقيق با هدف همسانه سازي ژن آنزيم كلسترول‌اكسيداز در يك سيستم بياني pET مناسب، جهت امكان هدايت پروتئين نوتركيب توليدشده به فضاي پري‌پلاسمي باكتري طراحي و اجرا شد. بدين منظور از ‌سويه باكتري (Rhodococcus sp. 502) بومي ايران، كه داراي فعاليت كلسترول‌اكسيدازي بالا بود، جهت جداسازي ژن با PCR استفاده شد. محصول PCR ابتدا در پلاسميد خطي pJET و در نهايت در پلاسميد pET23a كلون و داخل ميزبان (E.coli DH5α) ترانسفورم شد. پس از همسانه‌سازي و استخراج پلاسميد نوتركيب pET23a+cho و به‌منظور تأييد حضور ژن از آنزيم‌هاي HindIII و XhoI و تعيين توالي استفاده شده است. حضور باند 1600 جفت بازي در هضم آنزيمي  حضور ژن را تاييد كرد. نتايج حاصل از آناليز تعيين توالي حاكي از آن است كه توالي به‌‌دست ‌آمده شباهت زيادي با كلسترول‌اكسيداز سويه‌هاي ديگر باكتري Rhodococcusموجود در NCBI دارد، كه  از آن مي‌توان در راستاي توليد آفت‌كش بيولوژيكي در پنبه استفاده نمود.

Cholesterol oxidase enzyme, as a new generation of biological pesticides, has pesticides strong effect on the pest to cotton Heliothis armigera. The mechanism of action of cholesterol oxidase fatality related to the oxidation of cholesterol in the membranes of insect midgut epithelial which leads to physical destruction and the resulting disturbances in membrane structure and function and eventually death of the insect. In order to retrofitting genetically engineered plants against pests, production of them with the gene coding for cholesterol oxidase enzyme, require the best method for expression level and activity of this enzyme. Therefore, this study aimed to clone cholesterol oxidase enzyme in plasmid pET23a for possible guidance recombinant protein produced in bacterial periplasmic space. Rhodococcus sp. strain 502 that produce high level of cholesterol oxidase, was used for gene isolation by PCR. The PCR product was sub cloned in  plasmid pJET, subsequently for expression was cloned in pET23a, eventually was transformed into the host E.coli DH5α. Recombinant plasmid pET23a CHO was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. The results of sequencing showed high similarity between our isolated gene sequence and the other cholesterol oxidase gene sequences in NCBI that can be used for production of biological pesticide.