ايجاد جهش هدفدار در ژن IFNβ به منظور افزايش پايداري mRNA و سطح ترجمه آن با روش Megaprimer PCR

زمينه و اهداف: پروتئين اينترفرون بتا (IFNβ) به عنوان يك داروي نوتركيب توليد شده و در درمان برخي بيماري ها مثل مالتيپل اسكلروزيس استفاده مي شود. در سلول هاي يوكاريوتي mRNA IFNβ به سرعت تجزيه مي شود و نيمه عمر آن بسيار كوتاه است. يكي از عواملي كه باعث اين امر مي شود وجود توالي غني از AU (ARE) در UTR´3 اين mRNA مي باشد. اين ناحيه اثر مهاري بر ترجمه نيز دارد. هدف اين تحقيق حذف ARE از ژن اينترفرون بتا جهت افزايش پايداريmRNA و سطح ترجمه مي باشد. مواد و روش ها:به منظور حذف يك توالي 18 نوكلئوتيد از ARE از روش Megaprimer PCR استفاده شد. محصول PCR با آنزيم هاي EcoRI و BglII برش داده شد. وكتور نيز توسط همين آنزيم ها اما به صورت نسبي برش داده شد. محصول برش يافته PCR خالص سازي شد و داخل وكتور كلون شد. در ادامه وكتور نوتركيب حاصل به رده سلولي CHO ترانسفكت شدند. يافته ها: محصول مرحله اول واكنش PCR حاوي جهش حذفي بود و به عنوان مگاپرايمر در واكنش دوم استفاده شد. هضم نسبي وكتور، قطعاتي با وزن هاي مختلف ايجاد كرد. قطعه مورد نظر ما از ژل استخراج و به عنوان وكتور كلونينگ استفاده شد. محصول نهايي PCR داخل وكتور كلون شد. صحت واكنش كلونينگ تاييد شد و وكتور نوتركيب حاصل، به رده سلولي CHO ترانسفكت شد. نتيجه گيري: منطقه اي 18 نوكلئوتيدي از mRNA IFNβ حذف شد. اثر اين ميكروحذف بر پايداري mRNA و بازدهي ترجمه درآينده بررسي خواهد شد.