كلونينگ و بيان پروتيين سطحي HER2 انساني در سطح سلول‌هاي يوكاريوتي با استفاده از تكنيك‌هاي ترانسفكشن و ترانسداكشن به‌منظور توليد تومور در موش

Cloning and expression of human HER2 protein on eukaryotic cell surface by transfection and transduction techniques for tumorogenesis in a mouse model

مقدمه و هدف: سرطان پستان، پنجمين عامل شايع مرگ‌ومير در سراسر دنيا بوده و در بين زنان شايع‌ترين سرطان كشنده است. HER2 يك آنتي‌ژن سطحي است كه در حدود 30درصد سرطان‌هاي پستان، بيان افزايش‌يافته دارد. هدف اين مطالعه كلونينگ ژن گيرنده HER2 در وكتور بياني +pCDNA3.1/Hygro و بيان اين پروتيين در سلول‌هاي يوكاريوتي LL2 و ايجاد مدل موشي سرطان پستان مي‌باشد. مواد و روش‌ها: با تخليص RNA، تكثير ژن HER2 و كلون‌كردن آن در وكتور +pCDNA3.1/Hygro، سازه بيان‌كننده ژن HER2 ايجاد و ازطريق توالي‌يابي تاييد گشت. در مرحله بعد، اين سازه به سلول‌هاي سرطاني موشي LL2 منتقل گرديد. براي ايجاد رده سلولي پايدار، سلول‌هاي ترانسفكته به‌مدت يك ماه در محيط حاوي آنتي‌بيوتيك هيگرومايسين قرار داده شدند. سلول‌هاي حاصله، سرعت رشد كمي داشتند و منجر به ايجاد تومور نشدند. در كنار اين كار، از سلول‌هاي LL2 ترانسداكت‌شده با لنتي‌ويروس حاوي HER2 استفاده كرديم كه حدود 106 سلول ترانسداكت‌شده به موش‌هاي C57BL/6 به‌روش زيرجلدي تزريق گرديد. ده تا دوازده روز بعد از تزريق، تومور قابل‌لمس بود. نتايج: ژن HER2 با موفقيت تكثير و در وكتور پلاسميدي +pCDNA3.1/Hygro كلون شد. تزريق سلول‌هاي LL2 ترانسداكت و ترانسفكت‌شده با سازه حاوي HER2 به موش، نشان داد كه فقط سلول‌هاي LL2 ترانسداكت‌شده با وكتور ويروسي pLEX HER2 قادر به بيان پايدار HER2 انساني هستند. نتيجه‌گيري: با كلونينگ و بيان HER2 در سلول‌هاي يوكاريوتي LL2 مي‌توان مدل سرطان پستان HER2+ در موش ايجاد كرد.

Background and Objective: Breast cancer is the fifth common cause of death in the world and is considered as the leading cause of cancer related death among females. HER2 is a surface antigen which is overexpressed in 30% of breast cancer cases. The aim of this study was cloning of HER2 receptor gene in pCDNA3.1\Hygro+ expression vector, expression of this protein in LL2 eukaryotic cell line and production of a breast cancer mouse model. Materials and Methods: The construct expressing HER2 gene was synthesized by RNA extraction, HER2 gene amplification and its cloning into pCDNA3.1\Hygro+ vector. The accuracy of cloning was approved by sequencing. In the next step, the construct was transfected into LL2 mouse cancer cells. To establish a stable cell line, transfected LL2 cells were cultured in hygromycine enriched medium for 1 month. The resultant cells had a very low growth rate. Having repeated the process three times, 106 cells were eventually produced. Injection of these cells into mice led to no tumor formation. Moreover, LL2 cells transducted by HER2 containing lenti-viruse were used collaterally to form tumors. Meanwhile, 106 transducted LL2 cells were injected subcutaneously into C57BL/6 mice. A tumor nodule was tangible 10 to 12 days post injection. Results: The HER2 gene was successfully amplified and cloned into pcDNA3.1\Hygro+. Injection of transfected and transduced LL2 cells into mice demonstrated that only the LL2 cells transduced by the viral vector pLEX HER2 were able to express human HER2 gene stably. Conclusion: By cloning and expression of HER2 on the LL2 cells, we could produce breast cancer model in mice expressing human HER2 on cells surface.