بيان فاكتور رونويسي دوپامينرژيكي Nurr1 در سلول‏هاي انساني به‏وسيله لنتي ويروس‏هاي نوتركيب

Expression of Dopaminergic Transcription Factor Nurr1 in Human Cells Via Recombinant Lentiviruses

هدف: هدف اين تحقيق توليد  لنتي ويروس‏هاي حامل ژن Nurr1 و بيان در سلول‏هاي انساني مي‏باشد. مواد و روش‏ها: قطعه ژني IRESEGFP با آنزيم‏هاي Bgl ll/Not1 از ناقل pIRES2EGFP جدا و با Klenow كور (Blunt) گرديد. ناقل لنتي ويروسي  pNLEGFP/CMV/WPREdU3 با آنزيم‏هاي Nhe1/ Xho1 برش و دو سر آن  كور شد.  قطعه ژني ايزوله شده به اين ناقل منتقل شد تا سازه لنتي ويروسي (I) به‏وجود آيد. سپس ژن Nurr1  با آنزيم‏هاي Xho1 و BamH1 از ناقل PCMXNOT بريده و درون پلاسميد (I) خطي شده باSal1 و BamH1 منتقل شد تا سازه نهايي لنتي ويروسي (II) توليد گردد. براي توليد لنتي ويروس‏هاي نوتركيب، رده سلول انساني HEK293T  را با اين پلاسميد نهايي، به‏همراه پلاسميدهاي غشايي و بسته بندي لنتي ويروس ترانسفكت شد. محيط اين سلول‏ها كه مملو از ذرات ويروسي شده بود جمع آوري و از ستون آميكون عبور داده شد تا ذخيره غليظ ويروس به‏دست آيد. اين ذخيره براي آلوده سازي سلول‏هاي هدف استفاده شد. بيان EGFP در زير ميكروسكوپ به اثبات رسيد و بيان ژن Nurr1 با RTPCR سنجيده شد. نتايج: درستي مراحل كلونينگ با آنزيم‏هاي مربوطه اثبات شد. با ميكروسكوپ فلورسنس بيان Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در هر دو مرحله ترانسفكشن و ترانسدوكشن ثابت گرديد. تكنيك RTPCR بيان Nurr1 را در هردو مرحله به اثبات رسانيد. نتيجه گيري: لنتي ويروس‏هاي ناقل ژن انساني Nurr1 توليد شده و به‏دنبال آلوده سازي سلول‏هاي انساني HEK293T با ويروس‏هاي مزبور، سلولهاي فوق ژن Nurr1 را به‏طور موفقيت آميز بيان كردند.

Aim: The aim of this study was to generate recombinant lentiviruses carrying Nurr1 to express it in human cells. Material and methods: The IRESEGFP fragment was isolated from the pIRES2EGFP vector using restriction enzymes BglII/NotI and made bluntended using Klenow. The transfer vector PNLEGFP/CMV/WPREdU3 was digested with NheI/XhoI and made bluntended. Finally, the isolated IRESEGFP fragment was inserted into this lentivirus vector to generate lentivirus construct (I). The human Nurr1 gene was then isolated from the PCMXNOT vector using BamHI and XhoI and inserted into construct (I) predigested with BamHI and SalI. At this step lentivirus construct (II) as our final transfer construct was generated. In order to generate recombinant lentiviruses, we then transfected the HEK293T cell line with transfer vector plus packaging and envelope vectors. Cell medium full of virus particles was collected and passed through Amicon filters to produce a concentrated virus stock. The stock was ultimately used for transduction of fresh HEK293T cells. EGFP expression was shown under fluorescent microscope and Nurr1 expression was analyzed using RTPCR. Results: Enzymatic tests confirmed the correct cloning of the hNurr1gene into the lentivirus backbone. Observation by fluorescent microscopy showed EGFP expression posttransfection and posttransduction. RTPCR demonstrated Nurr1 expression at both stages. Conclusion: In this study, lentiviruses carrying the human Nurr1 gene were produced and used for transduction of human cell line HEK293T. The transduced cells successfully expressed the Nurr1 gene.