افزايش بقاي سلول‏هاي دوپامين ساز PC12 در برابر سميت 6OHDA با افزايش بيان فاكتور DJ1

Increased of dopaminergic PC12 cell survival against 6OHDAmediated toxicity following overexpression of DJ1 factor

هدف: هدف از اين مطالعه بررسي تاثير DJ1 بر افزايش بقاي سلول‏هاي دوپامين ساز در برابر سميت پاركينسوني  مي‏باشد. مواد و روش‏ها:  ابتدا لنتي ويروس‏هاي نوتركيب ناقل توام ژن هاي DJ1 و گزارش‏گر Jred توليد شده و براي آلوده سازي سلول‏ها استفاده شدند. بدين منظور سه پلاسميد لنتي ويروسي به‏نام‏هاي ناقل، بسته بندي و غشا براي ترانسفكشن سلول‏هاي HEK293T به‏عنوان رده سلولي مولد ويروس به‏كار برده شدند. محيط سلول‏هاي ترانسفكت شده 24 و 48 ساعت جمع آوري و تغليظ شد تا ذخيره لنتي ويروسي به‏دست آيد. به‏دنبال ترانسدوكشن سلول‏هاي دوپامين ساز PC12 با اين ذخيره غليظ ويروسي، سلول‏هاي مزبور افزايش بيان DJ1 را آغاز كردند. پس از تيمار اين سلول‏ها با توكسين 6OHDA، ميزان بقاي آن‏ها در مقايسه با شاهد اندازه‏گيري شد. نتايج: مراحل ترانسفكشن سلول‏هاي HEK293T و آلودگي سلول‏هاي PC12 با ذخيره ويروسي به‏طور موفقيت آميز به انجام رسيد، زيرا بيان ژن گزارش‏گر Jred با استفاده از ميكروسكوپ فلورسنس در هر دو مرحله مشاهده شد. سپس افزايش بيان DJ1 با تكنيك RT PCR اثبات شد. آزمايش‏هاي بعدي نشان داد كه افزايش بيان DJ1 باعث افزايش چشم‏گيري در بقاي سلول‏هاي PC12 در برابر سميت ناشي از 6OHDA مي‏شود. درصد بقاي سلول‏هاي PC12 كه افزايش بيان DJ1 داشتند، در حدود 30 درصد بيشتر از درصد بقاي سلول‏هاي كنترل برآورد شد و اين افزايش از نظر آماري معني‏دار بود. نتيجه‏گيري: افزايش بيان ژن DJ1 در سلول‏هاي دوپامين ساز PC12 مقاومت و بقاي اين سلول‏ها را در برابر سميت نوروني 6OHDA به‏طور معني‏دار و چشم‏گيري افزايش مي‏دهد.

Aim: The purpose of this study is to examine DJ1effect on increasing survival of dopaminergic (DAergic) cells against parkinsonian toxicity. Material and Methods: First recombinant lentiviruses transporters were produced with both DJ1 and reporter Jred genes and were used to cells infection. To this end, three lentiviruses vectors namely transporter, packaging and envelope were applied for cotransfection of HEK293T cells as virusproducing cell line. 24 and 48 hours transfected cell media were collected and concentrated till lentivirus stock generation. Following transduction of DAergic PC12 cells with this concentrated virus stock, the infected cells overexpressed DJ1. After treatment of these transduced cells with the 6OHDA toxin, their survival rate was measured in comparison with control. Results: Transfection HEK293T cells steps and PC12 cells transduction with the virus stock were done successful, because reporter Jred gene expression was observed using fluorescence microscope in both steps. Then DJ1 overexpression was proofed using RTPCR method. Next experiments indicated that DJ1 overexpression causes significant increase in PC12 cells survival against produced toxicity of 6OHDA. PC12 cell survival percentage that had DJ1overexpressing was 30% more than control cells survival percentage and this increasing was statistically significant. Conclusion: increasing of DJ1 expression in DAergic PC12 cells significantly increased their resistance and perpetuity against 6OHDA neurotoxicity.