طراحي و بهينه‌سازي تست PCR براي تشخيص سريع پاتوتايپ‌هاي انترواگريگيتيو و انتروتوكسي‌ژنيك اشرشياكلي

Design and Optimization of PCR Assay for Rapid Detection of Enterotoxigenic and Enteroaggregative Pathotypes of E. coli

زمینه و هدف: اشرشیاكلی به‌عنوان یكی از مهم‌ترین عوامل ایجادكننده بیماری اسهالی حاد در دنیا مطرح است. بیماری‌های اسهالی یكی از علل اصلی مرگ و میر در میان كودكان كشورهای درحال توسعه می‌باشند. این مطالعه با هدف توسعه تكنیك PCR برای تشخیص اختصاصی ژن‌های ویرولانس پاتوتایپ‌های انترتوكسی‌ژنیك اشرشیاكلی (ETEC) و انترواگریگیتیو و اشرشیاكلی (EAEC) انجام شد. روش بررسی: در این مطالعه برای تشخیص پاتوتایپ‌ها ETEC-EAEC، از ژن‌های اختصاصی st و lt (برای تشخیص پاتوتایپ ETEC) و از ژن اختصاصی aafII (برای شناسایی پاتوتایپ EAEC) استفاده شد. این تكنیك PCR برای این سه ژن طراحی و بهینه گردید. محصولات واكنش برای هریك از این ژن‌ها، در وكتور pTZ57R/T به‌عنوان كنترل مثبت، كلون و مورد استفاده قرار گرفت. میزان حساسیت پرایمر‌ها با محاسبه كمترین میزان تشخیص (Limit of Detection) و استفاده از ژنوم سایر باكتری‌ها به‌عنوان بررسی اختصاصیت پرایمر‌ها ارزیابی شد. یافته‌ها: با توجه به نتایج آنالیز محصولات PCR بر روی ژل الكتروفورز باند‌های مورد نظر برای ژن aafII، lt و st به ترتیب 384 ، 459 و 150 جفت باز به دست آمد. همچنین واكنش ژنوم باكتری‌های كنترل با پرایمر‌های طراحی‌شده، منفی بود. حد تشخیص براساس تعداد كپی برای ژن‌های st، lt و aafII به ترتیب برابر 390 ، 1500 و 2500 كپی به دست آمد. نتیجه‌گیری: با توجه به نتایج این مطالعه، طراحی این گونه تست‌ها در ایران به‌عنوان یك پیشرفت در زمینه بهبود تشخیص سریع و دقیق پاتوژن‌ها و تفكیك در نوع پاتوتایپ‌های اشرشیاكلی می‌باشد.

Background and Objectives: Escherichia coli is one of the most important causative agents of acute diarrheal disease in the world. Diarrheal diseases are one of the main causes of mortality among children in developing countries. The aim of this study was to develop a PCR technique for diagnosis of specific virulence genes of Enterotoxigenic E. coli (ETEC) and Enteroaggregative E. coli (EAEC). Methods: In this study, specific genes ST and LT were used for diagnosis of ETEC pathotype and AAF/II specific gene was used for diagnosis of EAEC pathotype. The PCR technique was designed and optimized for these three genes. The reaction products were cloned in pTZ57R/T vector as positive control. The primers’ sensitivity was determined by measurement of detection limit, and primers’ specificity was evaluated using other bacterial genomes. Results: According to the results of the PCR products analysis using agarose gel electrophoresis, the bands for AAF/II, LT, and ST were obtained 384, 459, and 150 bp, respectively. Also, the reaction of the genomes of control bacteria using the designed primers was negative. The detection limit based on copy number for ST, LT, and genes, was obtained 390, 1500, and 2500 copies, respectively. Conclusion: Considering the findings of this study, design of these assays in Iran is a progress in the improving rapid and accurate diagnosis of pathogens and detection of E. coli pathotypes.