ارايه روشي نوين در توليد آنتي‏بادي اختصاصي با استفاده ترتيبي از پروتيين نوتركيب و پپتيد (مدل PrIPeP)

Introduction of a New Method for Mono-specific Antibody Production by Sequential use of Recombinant Proteins and Synthetic Peptides (PrIPeP model)

هدف به‏دست آوردن آنتي‏بادي اختصاصي با ايمن‏سازي توسط پروتيين نوتركيب و خالص‏سازي به كمك پپتيد مصنوعي به‏عنوان روشي جديد (مدل PrIPeP). مواد و روش‌ها: آنتي‏ژن پروتييني با همسانه‏سازي ژن كامل SRY روي ناقل pET28a و بيان پروتيين نوتركيب آن در سويه Bl21 باكتري اشريشيا كلي توليد شد. پپتيدي اختصاصي از اين پروتيين نيز طراحي و پس از سنتز براي ساخت ستون خالص‏سازي استفاده شد. پروتيين نوتركيب در ادجوانت فروند به‏صورت امولسيون در آمد و طبق جدول زماني استاندارد براي ايمن‏سازي در خرگوش به‏كار رفت. به‏عنوان شاهد، پپتيد سنتز شده به پروتيين حامل KLH كونژوگه و مانند پروتيين نوتركيب براي ايمن‏سازي استفاده شد. براي بررسي نتايج، ابتدا درستي ايمن‏سازي به‏وسيله روش الايزا بررسي شد. سپس آنتي‏سرم حاصل از تزريق پروتيين نوتركيب (Pro-antisera) با استفاده از ستون خالص‏سازي شامل پپتيد كونژوگه به سفارز خالص‏سازي شد (مدل PrIPeP). آنتي‏سرم حاصل از تزريق پپتيد كونژوگه به KLH (Pep-antisera) نيز با همين ستون خالص‏سازي شد. در نهايت، اختصاصيت و حساسيت آنتي‏بادي‏هاي خالص شده نسبت به پروتيين نوتركيب SRY و همچنين چند شاهد منفي (پروتيين نوتركيب HSFY، RBMY و RPS4Y) با استفاده از روش لكه‏گذاري وسترن بررسي شد. نتايج: تيتراسيون با روش الايزا نشان داد كه ايمن‏سازي براي هر 2 نوع آنتي‏ژن به‏خوبي و به‏طور اختصاصي انجام شد. همچنين تجزيه و تحليل آنتي‏بادي‏هاي خالص كلاس IgG با روش لكه‏گذاري وسترن نشان داد كه اختصاصيت و حساسيت آنتي‏بادي در هر دو گروه مناسب است. نتيجه‌گيري: نتايج بررسي حاضر نشان داد كه با استفاده از مدل PrIPeP مي‏توان از يك سو به آنتي‏بادي‏هاي اختصاصي دست يافت كه عليه ساختار طبيعي پروتيين توليد شده‏اند و از سوي ديگر از چالش‏هاي كونژوگاسيون پپتيد به پروتيين حامل اجتناب كرد.

Objective: This study attempted to generate monospecific antibodies through immunization with recombinant proteins and subsequent purification by synthetic peptides (the PrIPeP model). Methods: The SRY gene was cloned on a pet-28a vector and the recombinant protein was expressed in the Escherichia coli (E.coli) BL21 strain. The purified antigen was emulsified in Freund’s adjuvant and injected into rabbits according to a standard time table. Then, a specific peptide was designed, synthesized, and conjugated to sepharose 4B to generate an affinity purification column. As a control, the peptide was conjugated to KLH and used for immunization, as above. Antisera against the conjugated peptide (Pep-antisera) and SRY recombinant protein (Pro-antisera) were evaluated by ELISA and subsequently subjected to the affinity purification column. Sensitivity and specificity of the purified antibodies against SRY recombinant protein as well as negative controls (recombinant HSFY, RBMY, and RPSFY) were assessed by Western blot analysis. Results: Titration by ELISA confirmed proper immunization and specificity of both antigens. Western blot analysis validated the specificity and sensitivity of the IgG class purified antibodies. Conclusion: By applying the PrIPeP model, it is possible to develop antibodies against the native structure of a protein whilst avoiding challenges of peptide-carrier protein conjugation.