همسانه‌سازي و بيان ژن زير واحد اتصالي سم شبه شيگا نوع ۲ و بررسي ايمني‌زايي آن در مدل حيواني

Cloning and Expression of the Binding Subunit of Shiga-Like Toxin Type 2 Gene and Immunization Study in an Animal Model

هدف: اشريشيا كلي انتروهموراژيك با قدرت توليد سم شبه شيگا نوع ? عامل اصلي اسهال خوني باكتريايي است. اين عامل بيمازي‏زا در برخي موارد مي‌تواند منجر به نشانگان اورمي هموليتيك و نارسايي كليوي با درجه مرگ ‌و مير بالا شود. توليد سم شبه شيگا نوع ? اصلي‌ترين عامل بيماري‌زايي سويه‌هاي اشريشيا كلي انتروهموراژيك است و از اين ‌رو خنثي‌سازي سم با آنتي‌بادي‌هاي سرمي اختصاصي به‌عنوان راه‏كار اصلي در روش‌هاي پيشگيري و درمان ضد نشانگان اورمي هموليتيك مطرح است. در اين تحقيق، همسانه‌سازي، بيان پروتيين نوتركيب، خالص‌سازي و ايمني‌زايي زيرواحد B سم شبه شيگا نوع ? (Stx2B) كه عامل اتصال سم به سلول‌هاي هدف است، شرح داده شده است. مواد و روش‌ها: ژن stx2B با استفاده از PCR تكثير و در ناقل بياني pET28a همسانه‌سازي و ناقل بياني به اشريشيا كلي BL21-DE3 منتقل شد. پروتيين نوتركيب rSTX2B پس از ارزيابي بيان با استفاده از ستون نيكل خالص‌سازي شد. پروتيين rSTX2B تخليص شده به‌عنوان كانديد ايمني‌زايي به روش زيرپوستي در سه مرحله به موش‌هاي نژاد Balb/c تزريق شد. توليد آنتي‌بادي سرمي ضد rSTX2B در خون موش‌هاي ايمن شده با استفاده از آزمون الايزا ارزيابي شد. خنثي‌سازي سم در شرايط آزمايشگاهي روي سلول‌هاي Hela و در شرايط درون بدني با آزمون چالش موش‌هاي ايمن با سم شبه شيگا نوع ? بررسي شد. نتايج: با بررسي ميزان IgG القا پاسخ ايمني عمومي در موش‌هاي ايمن شده تاييد شد. نتايج آزمون سلول‌هاي Hela نشان داد كه سرم موش‌هاي ايمن قادر به خنثي‌سازي سم است. در آزمون چالش حدود ?? درصد از موش‌هاي ايمن زنده ماندند. نتيجه‌گيري: نتايج نشان داد كه پروتيين نوتركيب rSTX2B مي‌تواند منجر به القاي پاسخ ايمني خنثي‌كننده در موش شود و مي‌تواند به‌عنوان يكي از اجزاي اصلي واكسن عليه اشريشيا كلي انتروهموراژيك به كار برده شود.

Objective: Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) which produces shiga-like toxin type 2 (Stx2) is a major cause of bloody diarrhea. This pathogen can lead to hemolytic uremic syndrome (HUS) and renal failure with a high mortality rate. Stx2 is the major virulence factor of EHEC. Neutralization of toxin by specific antibodies is known to be the best way to prevent and cure HUS. In this study, we describe the cloning, expression, purification, and immunization of the Stx2B subunit which is responsible for toxin binding to the target cell surface. Methods: The Stx2B gene was amplified by PCR and subcloned into a pET28a expression vector and transformed into E. coli BL21-DE3. We evaluated recombinant protein expression and rSTX2B was purified by the Ni-NTA column. The purified rSTX2B was administered subcutaneously to BALB/c mice in three separate doses as an immunogenic candidate. The raising of anti-rSTX2B antibodies in immunized mice sera was evaluated by Elisa assay. The neutralizing immune response was verified by an in vitro assay on HeLa cells and an in vivo assay on mice by challenging them with a lethal dose of Stx2. Results: The IgG titration verified the induction of a humeral response in immunized mice. The HeLa cell assay indicated that the Stx2 toxin was neutralized by immune mice sera. In the challenge assay, 70% of immunized mice survived. Conclusion: Recombinant rSTX2B can induce a neutralizing immune response in mice. It can be used as a major component in development of EHEC vaccines.