ساخت حامل ويروسي نوتركيب ناقل RNA كوتاه سنجاق سري اختصاصي عليه ژن Fndc5 موشي براي انتقال به سلول‏هاي بنيادي جنيني

Construction of Recombinant Lentiviral Vector Containing shRNA against Mouse Fndc5 Gene in Order to Transduce Mouse Embryonic Stem Cells

هدف: RNA مداخله‌گر يك مكانيسم كارآمد در كاهش بيان ژن‌ها و تعيين عملكرد ژن‌ها است. ناقل‏هاي لنتي ويروسي ابزارهاي مناسبي براي انتقال ژن‌هاي خارجي به طيف گسترده‌اي از سلول‌هاي پستانداران است. پروتيين Fndc5 يك پروتيين گليكوزيله غشايي است كه بيان آن طي روند تمايز قلبي و عصبي سلول‌هاي بنيادي جنيني موشي افزايش مي‌يابد. در اين مطالعه قابليت كاهش بيان ژن Fndc5 در سلول‌هاي بنيادي جنيني موشي با استفاده از ناقل‏هاي لنتي ويروسي بيان كننده RNA كوتاه سنجاق سري بررسي شد. مواد و روش‌ها: به اين منظور دو توالي مشخص RNA كوتاه سنجاق سري عليه ناحيه كد كننده رونوشت Fndc5 و يك توالي RNA كوتاه سنجاق سري كنترل به عنوان كنترل منفي طراحي و سنتز شد. قطعات RNA كوتاه سنجاق سري سنتزي پس از دورگه شدن درون ناقل لنتي ويروسي در پايين دست پروموتر H1 القا شونده توسط تتراسايكلين كلون شد. ناقل لنتي ويروس‌ نوتركيب درون سلول‌هاي HEK293T بسته‏بندي شد و سلول‌هاي بنيادي جنيني موشي توسط ذرات ويروسي ترانسداكت شدند. بيان RNA كوتاه سنجاق سري در سلول‌هاي ترانسداكت شده توسط 48 ساعت تيمار با داكسي‏سايكلين القا شد. نتايج: سنجش ميزان بيان رونوشت Fndc5 توسط Real-time PCR در سلول‌هاي ترانسداكت شده با ويروس‌هاي نوتركيب حامل هر دو RNA كوتاه سنجاق سري، كاهش بيان معني‏داري را نسبت به گروه كنترل نشان داد. نتيجه‌گيري: در مجموع هدف قرار دادن ژن‌ Fndc5 از طريق مكانيسم RNA مداخله‏گر مي‌تواند به‏عنوان يك ابزار كارآمد در كاهش بيان اين ژن در رده سلولي ترانسداكت شده به منظور بررسي عملكرد Fndc5 مورد توجه قرار بگيرد.

Objective: RNA interference (RNAi) is considered a potential approach to knock down target genes and their functional assessment. Lentiviral vectors serve as an efficient tool to transduce foreign genes in a wide variety of mammalian cells. Fibronectin type I domain-containing 5 (Fndc5) is a glycosylated membrane protein whose transcript levels increase during neural and cardiac differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs). Here, we report the efficacy of Fndc5 gene silencing in mESCs using lentiviral vectors that express shRNA. Methods: Two distinct shRNA sequences that targeted Fndc5 coding sequence (CDS) and one scramble shRNA sequence as a negative control were designed and commercially synthesized. Synthetic shRNA oligonucleotides were cloned into a lentiviral inducible vector after annealing downstream of the tetracycline inducible H1 promoter. The recombinant lentiviral vector was packaged in HEK293T cells, then mESCs were transduced by lentiviral particles. Expression of shRNA in transduced cell lines was induced by doxycycline treatment for 48 h. Results: Evaluation of transcript levels of Fndc5 by real-time PCR showed a significant decrease in transduced cells by a mixture of two shRNAs. Conclusion: Taken together, lentiviral-mediated RNAi that targeted the Fndc5 gene could be considered an efficient tool to silence gene expression in the transduced cell line to study the function of Fndc5.