مشكلات پيش روي تشخيص فيتوپلاسماها با استفاده از آزمون Nested PCR

توانمندي تشخيص و رديابي صحيح فيتوپلاسماها از گياهان، اهميت به سزايي در كنترل موثر اين عوامل و جلوگيري از گسترش آنها از طريق مواد گياهي آلوده دارد. استخراج DNA به گونه اي كه كمترين مواد ممانعت كننده و بيشترين ميزان ماده ژنتيكي فيتوپلاسما حاصل گردد، در موفقيت آزمون واكنش زنجيره اي پليمراز و صحت نتايج حاصل از آن تاثيرگذار است. در اين تحقيق، مقايسه روش هاي مختلف استخراج DNA نشان داد كه استفاده از روش مناسب، در كاهش واكنش منفي كاذب اهميت دارد. اما حتي در روش موفق استخراج DNA مبتني بر استفاده از ستون نيز واكنش هاي منفي كاذب هرچند به تعداد اندك اما به صورت پراكنده وجود دارد. اين امر مي تواند ناشي از غلظت پايين و پراكنش نامنظم سلول-هاي فيتوپلاسمايي در بافت هاي گياه ميزبان باشد. بر اساس نتايج حاصل از تعيين توالي قطعه تكثير شده با تركيب آغازگري P1/P7-R16F2n/R16R2، واكنش مثبت دروغين در برخي تكرارهاي آزمون Nested PCR به دست آمد. به منظور كاهش آلودگي هاي متقاطع و اجتناب از واكنش هاي مثبت دروغين، آزمون Single Tube Nested PCR بهينه سازي گرديد. عليرغم دستيابي به محاسن مختلف اين روش از جمله سهولت اجرا، صرفه جويي در هزينه و زمان و همچنين توان رديابي بيمارگر در غلظت هاي پايين، متاسفانه واكنش هاي مثبت كاذب در تعداد كمي از نمونه ها همچنان مشاهده شد. در مجموع نتايج حاصل از روش Nested PCR با يك تركيب آغازگري و به تنهايي براي رديابي و ارزيابي-هاي وسيع باغات و مزارع كفايت نمي كند و استفاده از تركيبات پرايمري مختلف، تعيين توالي و يا هضم آنزيمي به منظور اجتناب از واكنش مثبت دروغين توصيه مي گردد.