كاربرد نشانگرهاي ريزماهواره جهت شناسايي و ثبت ارقام زيتون

Application of microsatellite markers for identification and registration of olive cultivars

سابقه و هدف: زيتون شامل تقريباً 20 گونه درخت كوچك از خانواده Oleaceae بوده كه در جهان كهن از حوزه درياي مديترانه، شمال آفريقا، جنوب شرقي آسيا، شمال تا جنوب چين، اسكاتلند و شرق استراليا پراكندگي گسترده‌اي داشته‌اند. آن‌ها هميشه سبز بوده و داراي برگ‌هايي كوچك و يكپارچه هستند كه روبروي هم قرار گرفته‌اند. درخت زيتون به‌دليل مقاومت به كم‌آبي و سازگاري با خاك‌هاي كم‌بازده و فقير و توليد محصول كم‌هزينه، از نظر اقتصادي بسيار حايز اهميت است. در گذشته، روش‌هاي شناسايي ارقام مبتني‌بر خصوصيات ريخت شناختي برگ، ميوه، هسته و مغز هسته استوار بود، ولي جز در موارد خاص استفاده از اين صفات به تنهايي براي شناسايي ارقام كافي نمي‌باشد با توجه به شناسايي پيچيده ارقام زيتون با استفاده از صفات ريخت شناختي ابزارها مولكولي چشم‌انداز جديد براي انگشت‌نگاري DNA فراهم كرده‌اند در سال-هاي اخير فناوري نشانگرهاي DNA در گياهان عالي، به سمت استفاده از اين نشانگرها در انگشت‌نگاري DNA سوق يافته است. مواد و روش‌ها: انجام نمونه‌‌برداري پس از دريافت اطلاعات از موسسه ثبت و گواهي بذرو موسسه تحقيقات علوم باغباني صورت گرفت. نمونه‌گيري از سربرگ هاي جوان و تازه رشد كرده درخت به‌صورت سرشاخه انجام شد. 30 ميلي‌گرم از برگ توسط ازت كوبيده شده و استخراج DNA با استفاده از كيت استخراج DNA ساخت شركت Core Bio و بر پايه دستور‌العمل كيت انجام گرديد. در اين تحقيق مجموعاً از 22 نشانگر ريز ماهواره SSR استفاده شد. تجزيه خوشه اي به‌منظور شناسايي درختان مادري خارج از تيپ در بين درختان مادري يك رقم انجام شد. كليد‌هاي مولكولي اختصاصي به‌وسيله تجزيه‌هاي مولكولي بر روي 64 درخت مادري ارقام مورد مطالعه، شناسايي و در دو آزمايشگاه مولكولي مستقل واقع در پژوهشكده بيوتكنولوژي كشاورزي و موسسه تحقيقات ثبت و گواهي بذر و نهال تاييد شد. اكثر درختان مادري ارقام مختلف در گروه‌هاي مجزا طبقه‌بندي شدند. يافته‌ها: در اين تحقيق با استفاده از 22 نشانگر مولكولي SSR، كليد شناسايي مولكولي 11 رقم زيتون (Olea europaea L.) حاصل گرديد. نتايج نشان داد 10 نشانگر ريز ماهواره از بين نشانگرهاي به‌كار رفته در 11 رقم مورد مطالعه نوارهاي چند شكل ايجاد نمودند. نشانگرهاي MOL 1 در رقم تخم كبكي، MOL 7 در رقم‌هاي دزفولي، ماوي و روغني، MOL 8 در رقم دزفولي و شنگه، MOL 9 در رقم هاي دزفولي، گلوله، ماري و روغني، MOL 10 در رقم تخم كبكي، MOL 11 در رقم هاي دزفولي و فيشومي، MOL 14 در رقم دهقان، MOL 18 در رقم گلوله و MOL 20 در رقم ماري ايجاد باندهاي چند شكل اختصاصي نمودند. از ميان نشانگرهاي مورد استفاده، نشانگر MOL 9 به تنهايي قادر به شناسايي و تفكيك چهار رقم مهم زيتون ايران شامل دزفولي، گلوله، ماري و روغني از ساير ارقام مورد مطالعه بود. نتيجه‌گيري: با مشاهده دندروگرام حاصل از نرم‌افزار Splits Tree 4، درختان مادري ارقام مورد مطالعه زيتون با استفاده از 11 نشانگر SSR چند شكل نشان دادند. اكثر درختان مادري ارقام مختلف در گروه‌هاي مجزا طبقه‌بندي شدند. نتايج حاصل از ارتباط ژنتيكي به‌دست آمده با استفاده از روش مبتني‌بر مدل و روش خوشه‌اي بسيار مشابه هم بودند. با شناسايي كليد هاي شناسايي مولكولي ارقام مورد مطالعه، امكان تشخيص اين ارقام به‌منظور تاييد اصالت ژنتيكي آن‌ها ميسر گرديد.

Background and objectives: Oleaceae family contains approximately 20 species of small trees and ancient world of the Mediterranean, North Africa, Southeast Asia, north to southern China, Scotland and East Australia have a wide dispersion. They are evergreen and have small leaves that are integrated have been met. Olive trees resistant to drought and adapt to poor soils and produce high-value, low-cost and economically very important. In the past, methods for cultivar identification was based on morphological characteristics of leaves, fruits and kernels, but except in specific cases identification using morphological traits alone are not enough. Due to complex identification of young olive cultivars (Olea europaea L.) by morphological traits, advance molecular tools have provided a new prospect for DNA fingerprinting. Materials and Methods: For this study, sampling was done after receiving information from Horticulture Science Research Institute (HSRI) and Seed and Plant Certification and Registration Institute (SPCRI). Sampling was done from young and fresh shoot of trees. Approximately, 30 mg of young leaf were ground in liquid nitrogen and total DNA was isolated using the procedure described Core Bio DNA extraction kit and PCR-amplified using 22 pairs of primers flanking SSR sequences. Off-type trees were identified using cluster analysis based on SSR data. The specific molecular keys were verified on 64 olive motherʹs trees and the results were confirmed at two independent laboratories (SPCRI and Agriculture Biotechnology Research Institute of Iran). Most mother trees of different varieties were classified in separate groups. Results: Specific molecular keys were identified for 11 Iranian olive cultivars (Olea europaea L.) using 10 out of 22 SSR markers. The results showed that 10 SSR markers produced polymorphism or polymorphic bands for studied Iranian olive cultivars. SSR markers MOL 1 in Tokhme Kabki, MOL 7 in Dezfooli, Mavi and Roghani, MOL 8 in Dezfooli and Shangeh, MOL 9 in Dezfooli, Golooleh, Mari and Roghani, MOL 10 in Tokhmekabki, MOL 11 in Dezfooli and Fishemi, MOL 14 in Dehghan, MOL 18 in Golooleh, MOL 20 in Mari produced specific molecular keys. Out of 12 Iranian olive cultivars, four cultivars (Dezfooli, Golooleh, Mavi and Roghani) were identified by SSR marker MOL 9. Conclusion: Dendrogram of Splits Tree 4 software separated mother trees of studied olive cultivar with 11 SSR markers. The results demonstrated that cluster analysis and structure software, was very appropriate for study of genetic relationships among olive cultivars. The reported specific molecular keys can be efficiently used for identification of olive cultivars for Genetic authentication.