تمايز سلول‌هاي بنيادي اندومتر رحم به نورون حركتي با استفاده از ريز‌مولكول پورمورفامين

Differentiation of endometrial stem cells into motor neurons by the use of purmorphamin small molecule

زمینه و هدف: ریزمولكول پورمورفامین آگونیست پروتیین Smoothened در مسیر سیگنالینگ سونیك هچ‌هاگ  (Sonic hedgehog) است. استفاده از سونیك هچ‌هاگ باعث پیشروی تمایز عصبی می‌شود و سلول‌های تمایز یافته، پروتیین‌های ویژه‌ی بافت عصبی را بیان می‌كنند. نوروفیلامنت و استیل كولین ترانسفراز، پروتیین‌های ویژه نورون‌های حركتی هستند كه بیان آن‌ها در سلول‌های در حال تمایز نشان‌دهنده تبدیل آن‌ها به نورون‌های حركتی است. هدف از این مطالعه بررسی توانایی مولكول پورمورفامین در تمایز سلول‌های بنیادی اندومتریال به نورون حركتی است. روش بررسی: در این مطالعه تحلیلی كه در مهر ماه 1394 در دانشگاه علوم پزشكی تهران انجام گرفت، سلول‌های بنیادی به روش آنزیمی از بافت اندومتریوم رحم جداسازی شدند. پس از پاساژ سوم فلوسایتومتری برای ماركرهای مزانشیمی انجام شد. سپس سلول‌ها به دو گروه كنترل و تمایزی تقسیم شدند. در گروه تمایزی، سلول‌ها با محیط تمایزی حاوی پورمورفامین تیمار شدند. سپس تست ایمونوسیتوشیمی (ICC) و همچنین Real-time PCR برای بیان ماركرهای سلول‌های عصبی انجام شد.  یافته‌ها: آنالیز فلوسایتومتری نشان داد كه سلول‌های بنیادی اندومتریال برای CD90, CD105 و CD146 مثبت و برای CD31, CD34 منفی هستند. نتایج ICC و Real-time PCR نشان داد كه سلول‌های تیمار شده با پورمورفامین، ماركرهای نورون‌های حركتی نوروفیلامان و استیل كولین ترانسفراز را بیان می‌كنند. نتیجه‌گیری: بر اساس یافته‌های این پژوهش می‌توان نتیجه گرفت كه ریزمولكول پورمورفامین با فعال نمودن مسیر سیگنالینگ سونیك هچ‌هاگ توانایی القای تمایز سلول‌های بنیادی به سلول‌های عصبی، به‌ویژه نورون‌های حركتی را دارد.

Background: Small molecule Purmorphamin (PMA) is the agonist of smoothened protein in Sonic hedgehog (Shh) signaling pathway. Effect of purmorphamin small molecule on differentiation of mesenchymal cells into bone tissue has been studied previously. Use of Shh causes progression of neural differentiation, and the differentiated cells express specific neural markers. Neurofilament (NF) and acetylcholine esterase (Chat) are specific markers of motor neurons and their expression in differentiated cells indicates their conversion into motor neurons. The aim of this study was to evaluate the ability of PMA to differentiate the human endometrial stem cells (hEnSCs) into motor neurons. Methods: This analytical study was done in Tehran University of Medical Sciences laboratory on September of 2015. In this study hEnSCs were enzymatically extracted from endometrial tissue. After third passages, the flow cytometry was done for mesenchymal stem cells markers. The mesenchymal stem cells were divided into control and differentiated groups. FBS 10%+DMEM/F12 was added to the culture medium of control group and the differentiating group was treated with differentiating medium containing N2, PMA, DMEM/F12, FBS, B27, IBMX, 2ME, FGF2, RA, BDNF. After 21 days immunocytochemistry (ICC) test was done for the expression of NF and Chat proteins and Real-time PCR analysis for expression of neural markers such as NF, Chat, Nestin and GFAP (as glial marker) at mRNA level. Results: The flow cytometry analysis showed that hEnSCs were positive for mesenchymal markers CD90, CD105 and CD146 and negative for endothelial marker CD31, and hematopoietic marker CD34. The immunocytochemistry and Real time-PCR results showed that the cells treated with PMA expressed motor neuron markers of NF and Chat. Conclusion: According to the results of this study, it can be concluded that small molecule PMA has the potency to induce the differentiation of hEnSCs into neural cells, specifically motor neurons by activating Shh signaling pathway.