جداسازي و غربالگري سويه‌هاي بومي ريزوبيوم توليدكنندۀ ACC دآميناز و سيدروفور

Isolation and screening of native ACC deaminase and siderophore producing rhizobia

مقدمه: ريزوبيوم‌ها باكتري‌هايي هستند كه با گياهان زراعي خانوادۀ لگوم همزيستي دارند. باكتري‌هاي ريزوبيومي علاوه بر تثبيت نيتروژن، قابليت‌هاي ديگري از جمله توانايي توليد آمينو سيكلوپروپان كربوكسيلات دآميناز (ACC دآميناز) و سيدروفور را دارند، در ايجاد گرهك‌هاي بيشتر در شرايط مختلف محيطي موفق‌تر خواهند بود. هدف از اين مطالعه، غربال سويه‌هاي رايزوبيومي بومي توليدكنندۀ آنزيم ACC دآميناز و سيدروفور است. مواد و روش‌ها: براي جداسازي سويه‌هاي ريزوبيومي توليدكنندۀ ACC دآميناز، سويه‌ها روي محيط M9 با دو منبع نيتروژن (ACC و NH4Cl) كشت داده شدند. همچنين محيط M9 فاقد نيتروژن نيز به‌عنوان شاهد در نظر گرفته شد. براساس مقايسۀ آماري ميزان رشد سويه‌ها در محيط M9 حاوي ACC نسبت به دو محيط ديگر، سويه‌هاي توليدكنندۀ ACC دآميناز شناسايي شدند. براي جداسازي ريزوبيوم‌هاي توليدكنندۀ سيدروفور از روش سنجش مايع Chrome Azurol S (CAS) استفاده شد. تمام تيمارها در دو تكرار انجام گرفت و آناليز آماري در قالب طرح كاملاً تصادفي انجام گرفت. براي شناسايي بهترين سويه‌هاي توليدكنندۀ ACC دآميناز و سيدروفور از روش توالي‌يابي ژن 16S rDNAاستفاده شد. نتايج: در اين مطالعه 14 سويۀ ريزوبيوم به‌منظور توليد ACCدآميناز و سيدروفور جداسازي و غربالگري شدند. نتايج نشان داد كه از بين همۀ سويه‌ها، فقط سويۀ R8 داراي توان توليد آنزيم ACC دآميناز بود و اين سويه توانست رشد بهتري در محيط كشت M9+ACC نسبت به دو محيط M9 و M9+NH4Cl داشته باشد. در مرحلۀ بعد با استفاده از روش سنجش مايع CAS مشخص شد كه 8 سويه توانايي توليد سيدروفور را دارند. از بين آن‌ها سويۀ R12 بيشترين ميزان توليد سيدروفور را داشت. با توجه به نتايج آناليز مولكولي، سويه‌هاي R8 و R12 به‌عنوان Sinorhizobium melilotiشناسايي شدند. ‌ بحث و نتيجه‌گيري: به احتمال زياد وجود سويۀ R8 كه داراي توانايي توليد ACC دآميناز است مي‌تواند از آثار سوء اتيلن در هنگام گرهك‌زايي و نيز از تنش جلوگيري كند. از طرفي سويۀ R12 نيز كه توانايي توليد سيدروفور را دارد علاوه بر تسهيل گرهك‌زايي و تأمين نياز گياه به آهن، مي‌تواند اثر بازدارندگي بر پاتوژن‌هاي خاكزاد داشته باشد.

Introduction:Rhizobia are bacteria that have a symbiosis with legumes. Rhizobia that have some capabilities like ACC deaminase and siderophore production in addition to nitrogen fixation are successful competitors in different environmental conditions for production of more nodules. The aim of this study was the screening of ACC deaminase and siderophore producing Rhizobia. Materials and methods: For screening of ACC deaminase producing rhizobia, all isolates were cultured on M9 medium with two different nitrogen sources, ACC and NH4Cl, and M9 medium without nitrogen source was considered as a control treatment. ACC deaminase producing Rhizobia were identified based on statistical comparison of growth rate on M9 medium with ACC against other mediums. Chrome Azurol S (CAS) liquid assay was used for siderophore producing Rhizobia. All treatments repeated two times and all data analyzed in the base of the completely randomized design. 16S rRNA gene sequencing was used for identifying the best ACC deaminase and siderophore producing strain. Results: 14 isolates of Rhizobium were used for screening of ACC deaminase and siderophore producing isolates. Results showed that just R8 strain was isolated with the capability of ACC deaminase production. This isolate could have better growth on M9 with ACC than two other mediums. In the next experiment, it was determined that 8 isolates are siderophore producing rhizobia based on CAS liquid assay. The result showed that R12 isolate could produce more siderophore than others. According to 16S rRNA gene sequencing, R8 and R12 isolates identified as Sinorhizobium meliloti. Discussion and conclusion: The R8 strain that have the capability of ACC deaminase production probability can prevent adverse effects of ethylene during nodulation and abiotic stress. On the other side, R12 that are able to produce siderophore can prevent the growth of soil born pathogen in addition to facilitating nodulation and iron uptake by plants.