طراحي، سنتز، همسانه سازي، ارزيابي بيان و بررسي خاصيت ضد ميكروبي پروتئين دفنزين گندم (Triticum aestivum) در ميزبانE.coli

Design, synthesis, cloning, expression and evaluation of the antibacterial effect of wheat defensin (Triticum aestivum) in E.coli host

دفنزين هاي گياهي، خانواده اي از پپتيدهاي ضد ميكروبي كاتيوني كوچك و غني از سيستئين هستند كه فعاليت هاي ضد ميكروبي وسيعي دارند. هدف اين مطالعه طراحي، سنتز، همسانه سازي، بيان ژن دفنزين گندم(Triticum aestivum) و بررسي خاصيت ضد باكتري پروتئين نوتركيب حاصل بود. توالي ژن دفنزين به همراه ژن سومو (sumo)جهت افزايش حلالييت پروتئين و بيان بيشتر، توسط نرم افزارهاي مختلف بهينه سازي شده، سنتز و در وكتور pGH همسانه سازي شد. سپس توالي تركيبي سومو دفنزين در ناقل بياني pET32a(+) زير همسانه سازي و به سلول هاي باكتريايي (E.coli origami) منتقل گرديد. بيان ژن تحت القاي IPTG يك ميلي مولار در دماي 30 درجه سانتي گراد صورت گرفت و پروتئين نوتركيب توسط SDSPAGE و وسترن بلات بررسي شد. پروتئين نوتركيب، با وزن مولكولي حدود 38 كيلودالتون روي ژل SDSPAGE آناليز شد و توسط وسترن بلات تائيد گرديد. پس از برش پروتئين با آنزيم سومو پروتئاز، محصول به دست آمده براي بررسي اثر ضد باكتريايي مورد استفاده قرار گرفت. اثر پروتئين دفنزين گندم نوتركيب بر باكتريهاي بيماريزاي گياهي گرم منفي زانتوموناس آگزونوپوديس و سودوموناس سيرينگهو بر باكتريهاي گرم منفي و گرم مثبت بيماريزاي انساني مانند اشريشيا كولاي ، كلبسيلا پنومونيه ، استافيلوكوكوس اورئوس و باسيلوس سرئوس مورد ارزيابي قرار گرفت كه در برابر باكتريهاي زانتوموناس آگزونوپوديس، استافيلوكوكوس اورئوس و باسيلوس سرئوس اثر ضد باكتريايي از خود نشان داد. بر اساس ويژگي ضد ميكروبي دفنزين گندم، اين مطالعه مي تواند در معرفي اين پپتيد، به عنوان يك عامل ضد ميكروبي جديد، موثر باشد.

Plant defensins are a family of cationic antimicrobial peptides, small and cysteine rich that have a broad range of antibacterial effects. The aim of this study was designed, synthesis, cloning, expression of wheat defensin (Triticum aestivum) gene and evaluation of the antibacterial effect of recombinant protein. The defensin gene was fused to sumo gene for more expression and solubility and then was optimized by some software and was synthesized and cloned in pGH vector. Then sumo_defensin sequence was sub cloned into pET32a(+) vector and transformed into bacterial cells (E.coli origami). Gene expression was induced by 1mM IPTG in 30°C and proteins were analyzed by SDSPAGE and Western blotting.The fusion protein with a molecular weight of approximately 38 kDa was analyzed on SDSPAGE gel and confirmed by western blotting. After digestion of protein by Sumo protease, the antibacterial effect of the recombinant wheat defensin was evaluated on the plant pathogenic Gramnegative bacteria Xanthomonase axonopodis, Pseudomonas syringae and some human pathogenic Gramnegative and Grampositive bacteria such as E.coli and Klebsiella pneumoniae , Staphylococcus aureus and Bacillus cereus. In the end, recombinant wheat defensin had an antibacterial effect against Xanthomonase axonopodis, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus. Based on the antimicrobial characteristics of wheat defensin, this study can be effective to introduce a new antimicrobial agent.