همسانه‌سازي ژن پيروات دكربوكسيلاز مؤثر در توليد بيواتانول در باكتري اشرشيا كلاي

Cloning of affecting pyruvate decarboxylase gene in the production bioethanol of agricultural waste in the E.coli bacteria

مقدمه: اتانول ساختهشده از زيستتوده يكي از راهبردهاي بي نظير و سودمند از لحاظ اقتصادي و محيطي است و ميتواند به عنوان يك سوخت پاك و ايمن، جايگزين سوخت هاي فسيلي شود. مواد و روشها: در اين پژوهش كليديترين آنزيم مؤثر در مسير توليد اتانول زيستي (پيروات دكربوكسيلاز) از زايموموناس موبيليس انتخاب و در اشرشيا كلاي بهروش ذوبانجماد همسانه سازي شد. براي همسانه سازي ژن مدِنظر از آغازگرهاي اختصاصي ژن پيروات دكربوكسيلاز و واكنش پيسي آر استفاده شد. سپس ژن پيروات دكربوكسيلاز و پلاسميد pET 28a را آنزيمهاي محدودكننده Sal I و Xho I برش دادند؛ محصولاتي كه آنزيم ليگاز برش دادند در دماي ۱۶ درجه سانتيگراد و در مدت ۱۶ ساعت به همديگر متصل شدند. نتايج: كشت باكتريها در محيط كشت LB انتخابي نشان داد كه تنها كلونيهاي حاوي پلاسميد pET 28a قادر به رشد هستند. نتايج كلوني پيسي آر با آغازگرهاي اختصاصي باندهايي در اندازه تقريبي ۱۷۰۰ جفت باز را نشان داد. نتايج مربوط به پيسيآر پلاسميدهاي نوتركيب توسط آغازگر رفت راه انداز T7 و آغازگر برگشت ژن پيروات دكربوكسيلاز، جهت صحيح درج ژن در داخل پلاسميد را ثابت كرد و باندي بهاندازه ۱۸۸۵ جفت باز را نشان داد و نتايج هضم آنزيمي پلاسميدpET 28a pdc نوتركيب توسط آنزيمهاي Sal I و Xho I باندهاي مشابهي را آشكار كرد. درنهايت واكنش RT باند مورد انتظار ۱۷۰۰ جفت باز را نشان داد كه حاكي از بيان ژن مورد نظر در اين نمونه ها بود. بحث و نتيجه گيري: از مهمترين مشكلات در بيوسنتز اتانول، محدوديت عملكرد آنزيم هاي درگير در مسير بيوسنتز اتانول از مواد اوليه نظير ضايعات كشاورزي است؛ اين آنزيمها در تبديل مواد اوليه پليمري به مواد اوليه با ساختار ساده و قابل تخمير نقش اساسي دارند. به نظر ميرسد افزايش بيان ژن پيروات دكربوكسيلاز تحت كنترل پروموتور قوي T7 منجر به افزايش توليد محصول نهايي خواهد شد.

Introduction: Ethanol made by a biomass is one of the useful strategies in terms of economic and environmental and as a clean and safe energy to replace fossil fuels considered and examined. Materials and methods: In this study, key enzyme in the production of ethanol (Pyruvate decarboxylase) from Zymomonas mobilis bacteria was isolated and cloned at E. coli bacteria by freeze and thaw method. For gene cloning, we used specific primers of pdc and PCR reaction and then pdc gene isolated and pET 28a plasmid double digested with (Sal I and Xho I) enzymes. Digestion Products were ligated by T4 DNA ligase in 16 °C for 16 hours. Results: Results of bacteria culture showed that a few colonies containing pET 28a plasmid could grow. Result of colony pcr of pdc gene with specific primers revealed 1700 bp bands in 1% agarose gel electrophoresis. The results of PCR with T7 promotor forward primer and pdc revers primer have proved the accurate direction of integration of pdc gene into plasmid and revealed 1885 bp band. Double digestion of recombinant plasmid with SalI and XhoI enzymes revealed same bands. Finally, RT showed the expected band of 1700 bp that implies the desired gene expression in the samples. Discussion and conclusion: Due to the increased production of ethanol via pyruvate decarboxylase gene cloning in expression plasmids with a strong promoter upstream of the cloning site can conclude that, pyruvate decarboxylase cloning as a key gene would be useful and according to beneficial properties of E. coli bacteria, transfering the gene to bacteria appears to be reasonable.