ايجاد جهش نقطه اي در اسيد آمينه 263 ژن استرپتوكيناز و كلونينگ و بيان پروتئين جهش يافته حاوي سيستئين

استرپتوكيناز يكي از شناخته ­شده ­ترين عوامل ترومبوليتيك با مصرف باليني گسترده است. با وجود اين، كاربرد آن به­ دليل ايمونوژن بودن، ايجاد عوارض هموراژيك و نيمه­عمر نسبتاً كوتاه، همراه با خطرهايي است. پگيلاسيون اختصاصي بر روي اسيدآمينه سيستئين، تكنيكي مفيد جهت كاهش بسياري از اين عوارض است. هدف از مطالعه حاضر، طراحي و توليد مولكول استرپتوكيناز جهش ­يافته حاوي سيستئين است كه براي پگيلاسيون اختصاصي قابل­ استفاده باشد. اسيدگلوتاميك 263 استرپتوكيناز، كه يك اسيدآمينه سطحي در ساختار پروتئين استرپتوكيناز است، براي انجام جهش و تعويض با سيستئين انتخاب­شد. براي نيل به اين هدف، با به­ كارگيري روش SOEing PCR، جهش بر روي كدون GLU263 ژن استرپتوكيناز براي تبديل به كدون سيستئين انجام شد. سپس، ژن استرپتوكيناز دست ­نخورده و جهش­ يافته در وكتور بياني pET-26b (+) وارد شدند. ساختارهاي حاصل درون اشريشيا كلي Rosetta (DE3) ترنسفرم شده و توسط القا با IPTG بيان شدند. درنهايت، توليد پروتئين­ ها به­ وسيله آزمون­ هاي SDS-PAGE و وسترن بلاتينگ تاييد شد. پروتئين­ ها به­ وسيله افينيتي كروماتوگرافي با ستون Ni-NTA agarose در شرايط دناتوره با اوره تخليص شدند و براي حذف اوره و تاخوردگي مجدد پروتئين­ ها از فيلتراسيون ژلي با سفادكس G-25استفاده شد. نتايج اين مطالعه نشان داد كه با استفاده از وكتور و ميزبان مذكور ژن جهش­ يافته حاوي كدون سيستئين به­ خوبي بيان مي ­شود و براي پگيلاسيون اختصاصي مناسب خواهد بود.