تشخيص ژن Stx1 درشيگلا ديسانتريه جدا شده از نمونه هاي باليني در استان مازندران با استفاده ازتكنيك PCRELISA

Detection of Shigella dysenteriae STX1 gene from Mazandaran province clinical samples by PCRELISA method

هدف: در ميان باكتريهاي خانواده آنتروباكترياسه، شيگلا ديسانتريه بدليل توليد توكسين پروتئيني تحت عنوان شيگاتوكسين با داشتن فعاليت سيتوتوكسيني و نوروتوكسيني موجب بيماريهايي اسهال، گاستروانتريت و اختلال ا نعقاد داخل عروقي مي شود كه امروزه به عنوان مهمترين چالش براي سلامتي انسانها مطرح مي باشند. هر چند روشهاي كلاسيك ومتداول ميكروبيولوژي براي تشخيص حساس واختصاصي مي باشند اما محدوديت هاي خاص خود را دارند. لذا اين مطالعه بمنظور رفع محدوديت ها و شناسايي توكسين Stx1 در كمترين زمان و ميزان در شيگلا ديسا نتريه با حساسيت و اختصاصيت بالا بوسيله تكنيكPCRELISA انجام شد. مواد وروش ها: توالي Stx1 (bp490) بعنوان ژن هدف با استفاده از DIGdUTP نشاندار تكثير و سپس محصول نشاندار شده كف ميكروپليت الايزا كوت شده و در نهايت با استفاده از آنتي بادي ضد ديگوكسي ژنين كانژوگه شناسايي انجام شد. همچنين حساسيت و اختصاصيت اين تكنيك با نمونه هاي باليني مورد بررسي قرار گرفت. يافته ها : حساسيت تشخيص باكتري در نمونه بررسي شده با استفاده از DNA ژنومي pg 56/1 براي شيگلا ديسانتريه تعيين ودر بررسي اختصاصيت اين تكنيك بغير از شيگلا ديسانتريه ديگر گونه هاي خانواده انتروباكترياسه جذب قابل قبولي نداشتند . اليزا مربوط بهDNA ژنومي تا رقت 156/0 پيكوگرم ازجذب معني داري داشت. از 70 نمونه باليني مورد بررسي 3 نمونه حاوي ژن stx1 با اين تكنيك شناسايي شد. نتيجه گيري: كارايي تكنيك PCRELISA نشان داد علاوه بر سادگي، سريع بودن و برخورداري از حساسيت واختصاصيت بالا جايگزيني مناسب براي روش كشت و PCR مي باشد و براحتي قابليت كاربردي شدن در هر آزمايشگاه طبي را دارد.

Background:Among enterobacteriaceae bacteria, Shigella dysenteriae produce a shiga protein toxin, and have cytotoxicity, enterotoxin and neurotoxin activity. The toxin causes diseases such as diarrhea, gastroenteritis, intravascular coagulation disorder. Today diarrhea is the most important challenge for the human health. The classic and conventional microbiological detection methods are sensitive and specificity, there is limitation. This study was designed to identify shigella dysenteriae in shortest time and the amount of toxin Stx1 with high sensitivity and specificity by using PCRELISA method. Method and material: The Stx1 sequence (490bp) as a target gene was amplified by DigdUTP labeled, then product was coating on microplate and by using anti antibody digoxigenin conjugated detection was done. Also the specificity and sensitivity of method with clinical specimens examined. Results: Sensitivity detection of bacteria in the sample using genomic DNA for Shigella dysenteriae was 1/56pg and specificity of technique didn’t showed acceptable OD in other species of enterobacteriaceae family. ELISA for genomic DNA Up to dilution 0/156 pg had significant absorption. As well as from 70 clinical samples which was analyzed, 3 samples contained stx1 gene. Conclusion: Efficiency PCRELISA techniques showed that it was simple, faster, high specific and sensitive methods. This technique is more suitable than culture and PCR method also it was easily can applied in each medical laboratory.